Funktionelle Analyse von NaOCl-sensitiven Thiol-Schaltern und deren Einfluss auf das Bacillithiol-Redoxpotential in Staphylococcus aureus

The Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus colonises asymptomatically ca. 30% of the human population. However, S. aureus is also a major human pathogen and can cause a wide range of live-threatening diseases, such as soft tissue infections, systemic and invasive diseases. In addition, S. aureus has acquired resistance to multiple antibiotics. The pathogen is well adapted to its host, which enables the bacterium to evade the host immune system. Under infections or in its ecological niche, S. aureus is exposed to reactive oxygen species and reactive chlorine species (ROS, RCS), such as H2O2 and HOCl, which are produced by macrophages, neutrophils or competitive bacteria. Therefore, S. aureus has evolved mechanisms to defend itself against oxidative stress, including antioxidant enzymes or low molecular weight (LMW) thiols. Eukaryotes and Gram-negative bacteria utilize the tripeptide glutathione (GSH), while Actinomycetes use mycothiol (MSH) as their major LMW thiol. However, S. aureus lacks GSH and MSH biosynthetic genes. Instead, S. aureus uses bacillithiol (BSH) and coenzyme A (CoASH) as an alternative LMW thiol. These small molecules play an essential role in detoxification of ROS and RCS as well as in maintenance of the reduced redox homeostasis inside the cell under different kinds of stress. An overview of the large functional diversity of BSH in Bacillus subtilis and S. aureus is presented in chapter 1. LMW thiols are important for the redox homeostasis. Thus, redox biology research often focuses on the function of LMW thiols on the cellular redox potential. During the last decades, genetically encoded redox-sensitive green fluorescent protein (roGFP2)-fused biosensors were established as tools for real-time monitoring of dynamic changes of the redox potential. Glutaredoxins (Grx), mycoredoxins (Mrx) and bacilliredoxins (Brx) were fused to roGFP2 to monitor changes of the redox potential in high spatiotemporal resolution in eukaryotes and bacteria. The applications of several roGFP2-fused biosensors in pathogenic bacteria under oxidative stress and infection conditions are summarized in chapter 2. Under oxidative stress and infections, BSH and CoASH can function as redox modifications of protein thiols, leading to S-thiolations. These mixed protein disulfides are termed as S-bacillithiolations or CoAlations. S-thiolations function in redox regulation of proteins and protect proteins against overoxidation to sulfonic acids. S-bacillithiolations can be reduced by bacilliredoxins (Brx), resulting in S-bacillithiolated Brx, which are reduced by another molecule of BSH, leading to bacillithiol disulfide (BSSB). For a long time, it was postulated that the NADPH-dependent flavin oxidoreductase YpdA might function as a BSSB reductase. Thus, the investigation of the physiological role of YpdA and the Brx/BSH/YpdA redox pathway under oxidative stress and infections in S. aureus was a subject of this PhD thesis and is presented in chapter 3. Our results demonstrated that YpdA acts as the BSSB reductase in vitro and in vivo. The enzymatic activity of YpdA was shown to depend on the conserved Cys14 residue. Using genetically encoded Brx-roGFP2 and Tpx-roGFP2 biosensors and HPLC metabolomics, we revealed that the S. aureus ΔypdA mutant has significantly higher BSSB levels and is impaired in the regeneration of the reduced BSH redox potential (EBSH). These results indicated that YpdA is important to maintain the redox homeostasis and to restore the reduced EBSH after oxidative stress. Phenotype analyses showed that YpdA improves the survival after oxidative stress and under infection conditions and thus, it is involved in the virulence of S. aureus. In addition, we demonstrated that YpdA acts together with BSH and BrxA in the BrxA/BSH/YpdA redox pathway. Moreover, we showed that BrxA contributes also to the fitness of S. aureus under oxidative stress and infections. S. aureus rapidly acquires resistance to multiple antibiotics, resulting in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains. To combat S. aureus infections, the development of new antimicrobial compounds is required. Quinones are potent antimicrobial substances because of their bivalent mode of action as electrophiles and oxidants. In this doctoral thesis, we investigated the antimicrobial effect and mode of action of the plant-derived 1,4-naphthoquinone lapachol in S. aureus (chapter 4). Phenotype analyses, using growth and survival assays, demonstrated that lapachol is growth-inhibitory and lethal for S. aureus. The antimicrobial effect of lapachol in S. aureus depends strongly on oxygen availability, since the toxicity of lapachol was decreased in survival assays under microaerophilic conditions compared to aerobic conditions. As revealed by RNA-seq, lapachol induces a strong quinone-specific and oxidative stress response in S. aureus. Furthermore, applications of the Brx- roGFP2 and Tpx-roGFP2 biosensors showed that S. aureus exhibits an increased EBSH and enhanced intracellular H2O2 levels after lapachol stress, indicating ROS-production by lapachol. ROS-induction by lapachol can induce S-bacillithiolations of GapDH in S aureus in vitro and in vivo. Moreover, the addition of the ROS scavenger N-acetyl cysteine to lapachol-stressed S. aureus cells improves the survival of the bacteria. The H2O2-scavenging catalase (KatA) and the BrxA/BSH/YpdA redox pathway were further shown to be essential for survival under lapachol treatment. In addition, no protein aggregation has been detected in vitro and in vivo after lapachol stress, supporting that lapachol does not act via the S-alkylating mode. In conclusion, the results of this PhD thesis provided new insights in the maintenance of the BSH redox homeostasis in S. aureus under oxidative stress, infection conditions and antibiotics treatment. The BSSB reductase YpdA was shown to play a crucial role in redox homeostasis and is a part of the BrxA/BSH/YpdA redox pathway, which contributes to the virulence of S. aureus. Furthermore, the BrxA/BSH/YpdA redox pathway has been shown to protect S. aureus against ROS, produced in the oxidative mode of lapachol stress. In the future, YpdA could be a novel drug target. Also, lapachol and its derivatives could be applied as new antimicrobials to combat life-threatening MRSA infections.Das grampositive Bakterium Staphylococcus aureus kolonisiert asymptomatisch ca. 30 % der menschlichen Bevölkerung. Jedoch ist S. aureus auch ein wichtiger humanpathogener Infektionserreger und verursacht viele lebensbedrohliche, invasive und systemische Erkrankungen. S. aureus hat zahlreiche Antibiotikaresistenzen erworben und ist gut an seinem Wirt angepasst, wodurch es dem Bakterium ermöglicht wird, das Immunsystem des Wirts zu umgehen. Unter Infektionsbedingungen oder in seiner ökologischen Nische ist S. aureus verschiedenen reaktiven Sauerstoff- und Chlor-Spezies (ROS, RCS) ausgesetzt, wie zum Beispiel H2O2 und HOCl, die von Makrophagen, Neutrophilen oder konkurrierenden Bakterien produziert werden. Daher hat S. aureus viele Mechanismen zur Abwehr gegen oxidativem Stress entwickelt, wie z. B. antioxidative Enzyme oder niedermolekulare Thiolverbindungen. Eukaryoten und gramnegative Bakterien verwenden das Tripeptid Glutathion (GSH) und Actinomyceten nutzen Mycothiol (MSH) als niedermolekulare Thiolverbindungen. Allerdings fehlen S. aureus die Gene für die Biosynthese von GSH und MSH. Stattdessen nutzt S. aureus Bacillithiol (BSH) und Coenzym A (CoASH) als alternative niedermolekulare Thiolverbindungen. Diese Metabolite spielen eine essentielle Rolle bei der Entgiftung von ROS und RCS sowie bei der Aufrechterhaltung der reduzierten Redox-Homöostase in der Zelle bei verschiedenen Arten von Stress. Ein Überblick über die Biosynthese und Funktionen von BSH in Bacillus subtilis und S. aureus wird im Kapitel 1 gegeben. Niedermolekulare Thiolverbindungen spielen eine wichtige Rolle in der Redox-Homöostase aller Zellen. Deshalb ist die Untersuchung des zellulären Redoxpotentials ein Schwerpunkt in der Forschung der Redoxbiologie. In den letzten Jahrzehnten wurden neue genetisch-kodierte Redox-Biosensoren entwickelt, basierend auf dem redox-sensitiven grün-fluoreszierenden Protein (roGFP2). Dadurch konnte die Messung dynamischer Veränderungen des zellulären Redoxpotentials in Echtzeit durchgeführt werden. Dabei werden Redoxine, wie z. B. Glutaredoxin (Grx), Mycoredoxin (Mrx) oder Bacilliredoxin (Brx), an roGFP2 gekoppelt, um in hoher räumlich-zeitlicher Auflösung Veränderungen des Redoxpotentials in Eukaryoten und Prokaryoten zu messen. Die Anwendungen einiger roGFP2-fusionierter Biosensoren in pathogenen Bakterien unter oxidativen Stress und Infektionsbedingungen sind im Kapitel 2 zusammengefasst. Bei oxidativen Stress und Infektionen können BSH und CoASH Proteine durch S-Thiolierungen posttranslational modifizieren. Diese gemischten Protein-Disulfide werden in S. aureus als S-Bacillithiolierungen oder CoA-Thiolierungen bezeichnet. Durch S-Thiolierungen wird die Aktivität von Proteinen reguliert und ein Schutz der Proteine vor Überoxidation zur irreversiblen Cystein-Sulfonsäure vermittelt. S-Bacillithiolierungen können durch Bacilliredoxine (Brx) reduziert werden, wodurch Brx selbst S-bacillithioliert wird. Brx kann durch ein weiteres BSH-Molekül reduziert werden, wobei Bacillithiol-Disulfid (BSSB) entsteht. Lange Zeit wurde angenommen, dass die NADPH-abhängige Flavin-Oxidoreduktase YpdA als BSSB-Reduktase fungiert. Die Untersuchung der physiologischen Rolle von YpdA und des Brx/BSH/YpdA-Weges in S. aureus unter oxidativen Stress und Infektionsbedingungen wird in Kapitel 3 als ein Hauptteil der Promotionsarbeit beschrieben. Wir konnten zeigen, dass YpdA in vitro und in vivo als BSSB-Reduktase fungiert. In vitro hängt die enzymatische Aktivität von YpdA vom konservierten Cystein-14 ab. Mittels genetisch-kodierter Brx-roGFP2 und Tpx-roGFP2 Biosensoren und HPLC-Metabolomanalysen konnte ich zeigen, dass die S. aureus ΔypdA-Mutante deutlich höhere BSSB-Mengen aufweist und bei der Regeneration des reduzierten BSH-Redoxpotentials (EBSH) beeinträchtigt ist. Somit besitzt YpdA eine wichtige Funktion bei der Aufrechterhaltung der Redox-Homöostase und zur Regeneration des reduzierten EBSH nach oxidativem Stress. Phänotyp-Analysen zeigten, dass YpdA wichtig ist für das Überleben von S. aureus nach oxidativem Stress und unter Infektionsbedingungen und damit in die Virulenz involviert ist. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass YpdA zusammen mit BSH und BrxA im BrxA/BSH/YpdA-Redoxweg interagiert. Zusätzlich ist BrxA von Bedeutung für die Fitness von S. aureus unter oxidativem Stress und Infektionsbedingungen. S. aureus kann schnell Antibiotikaresistenzen erwerben, wodurch sich unter anderem Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) Stämme entwickelt haben. Um S. aureus-Infektionen erfolgreich bekämpfen zu können, ist die Entwicklung neuer antimikrobieller Substanzen notwendig. Chinone sind aufgrund ihrer beiden Wirk-mechanismen als Elektrophile und Oxidantien starke antimikrobielle Substanzen. In der vorliegenden Dissertation habe ich weiterhin in Kapitel 4 die antimikrobielle Wirkung und den Wirkmechanismus des natürlichen 1,4-Naphthochinons Lapachol in S. aureus untersucht. In Phänotyp-Analysen mittels Wachstums- und Überlebensversuchen zeigte Lapachol eine Wachstums-inhibierende und letale Wirkung in S. aureus. Dabei ist die antimikrobielle Wirkung von Lapachol in S. aureus von Sauerstoff abhängig, da die toxische Wirkung von Lapachol in Überlebensversuchen unter mikroaerophillen Bedingungen im Vergleich zu aeroben Bedingungen deutlich vermindert war. Durch RNA-Seq wurde gezeigt, dass Lapachol sowohl eine Chinon-spezifische Antwort als auch eine oxidative Stressantwort in S. aureus auslöst. Des Weiteren konnte durch die Brx roGFP2 und Tpx-roGFP2 Biosensoren gezeigt werden, dass S. aureus ein oxidiertes EBSH und eine erhöhte intrazelluläre H2O2-Menge nach Lapachol-Stress aufweist, was den oxidativen Wirkmechanismus der ROS-Produktion bestätigt. Lapachol-induziertes ROS bewirkt die S-Bacillithiolierung von GapDH in vitro und in S. aureus in vivo. Das aerobe Wachstum von S. aureus konnte durch N-Acteylcystein nach Lapachol-Stress verbessert werden. Phänotyp-Untersuchungen zeigten wichtige Funktionen der H2O2-entgiftenden Katalase (KatA) und des BrxA/BSH/YpdA-Redoxweges im Wachstum und Überleben von S. aureus nach Lapachol-Stress. Außerdem konnte keine Proteinaggregation in vitro und in vivo nach Lapachol-Stress nachgewiesen werden, was die Wirkung von Lapachol über S-Alkylierung und Aggregation von Proteinen widerlegt. Zusammenfassend wurden in der Dissertation neue Erkenntnisse zur Aufrecht-erhaltung der BSH-Redoxbalance in S. aureus unter oxidativen Stress, Infektionsbedingungen und Antibiotika-Stress erzielt. Dabei spielt YpdA eine entscheidende Rolle und ist ein Teil des BrxA/BSH/YpdA-Redoxweges, der an der Virulenz von S. aureus beteiligt ist. Des Weiteren konnten wir ebenfalls eine Rolle des BrxA/BSH/YpdA-Weges beim Schutz von S. aureus unter Lapachol-Stress, welcher ROS-Produktion und oxidativen Stress in S. aureus verursacht, zeigen. Zukünftig könnte YpdA ein neues Ziel für die Entwicklung von Antibiotika sein und Lapachol und dessen Derivate als neue antimikrobielle Substanzen angewendet werden, um MRSA-Infektionen zu bekämpfen