Étude du mécanisme d'action d'un peptide antifongique de la famille des héliomicines pour contrôler le champignon phytopathogène Botrytis cinerea

Phytopathogenic fungi are the main cause of crop diseases. Botrytis cinerea is a necrotrophic fungus, responsible for the gray mold, targeting many plants of agronomic interest (tomato, grapevine, strawberry). The extensive control of this disease integrates research for new antifungal solutions derived from natural molecules such as antimicrobial peptides (AMPs). The peptide ETD151 is an exclusively antifungal AMP optimized from heliomicin, an insect defensin from the butterfly Heliothis virescens. This small cationic, cysteine-rich and non-cytotoxic peptide demonstrates a promising in vitro activity on phytopathogenic fungi including B. cinerea. Using multidisciplinary approaches (proteomics, sphingolipidomics, confocal microscopy), this thesis focused on a better understanding of the mechanism of action of ETD151, with the eventual goal of developing a new crop protection strategy. As a first step, bottom-up proteomic studies were conducted on B. cinerea mycelium in the presence or absence of the peptide. Differential analysis of the results allowed us to identify proteins and metabolic pathways, such as the respiratory chain, impacted by ETD151. Thereafter and based on its strong homology with heliomicin, we have demonstrated the prominent role of membrane lipids called glucosylceramides in the activity of ETD151. Two forms Bc-GlcCer-2 and Bc-GlcCer-3 have been characterized by mass spectrometry in B. cinerea and explain the sensitivity of the fungus to the antifungal peptide. These results contributed to the current protein-lipid interaction studies in NMR. Finally, we have been able to define ETD151 as a morphogenic defensin in B. cinerea, as a few insects and plants antifungal defensins. Indeed, the peptide inhibits spore germination and hyphal elongation while at the same time altering the morphology of the fungus. It also disrupts the membrane integrity and leads to the release of intracellular content, non-mechanically and without acting directly on the high-osmolarity glycerol pathway. By combination with BODIPY fluorophore, we have revealed a particular affinity of ETD151 for the cell envelope and its internalization.Les champignons phytopathogènes sont la principale cause de maladies chez les plantes cultivées. Botrytis cinerea est un champignon nécrotrophe, responsable de la pourriture grise, ciblant de nombreuses cultures d’intérêt agronomique (tomate, vigne, fraise). La lutte contre ce pathogène intègre la recherche de nouvelles solutions antifongiques dérivées de molécules naturelles telles que les peptides antimicrobiens (PAMs). Le peptide ETD151 est un PAM exclusivement antifongique optimisé à partir de l’héliomicine, une défensine d’insecte isolée chez le papillon Heliothis virescens. Ce petit peptide cationique, riche en cystéine et non-cytotoxique démontre une activité in vitro prometteuse sur les champignons phytopathogènes dont B. cinerea. Ces travaux de thèse ont visé par des approches pluridisciplinaires (protéomique, sphingolipidomique, microscopie confocale) à une meilleure compréhension du mécanisme d’action du peptide ETD151, dans le but éventuel de développer une nouvelle stratégie de protection des cultures. Dans un premier temps, des études protéomiques de type « bottom-up » ont été conduites sur du mycélium de B. cinerea en présence ou absence du peptide. L’analyse différentielle des résultats a permis d’identifier des protéines et des voies métaboliques, telle que la chaîne respiratoire, impactées par l’ETD151. Dans un second temps et en s’appuyant sur sa forte homologie avec l’héliomicine, nous avons démontré le rôle prépondérant de certains lipides membranaires appelés glucosylcéramides dans l’activité de l’ETD151. Deux formes de ces lipides, Bc-GlcCer-2 et Bc GlcCer-3, ont été caractérisées par spectrométrie de masse chez B. cinerea et permettent d’expliquer la sensibilité du champignon au peptide antifongique. Ces résultats ont guidé les études d’interaction protéine-lipide par RMN actuellement en cours. Enfin, nous avons pu définir l’ETD151 comme une défensine morphogénique chez B. cinerea, à l’instar de certaines défensines antifongiques d’insectes et de plantes. En effet, le peptide inhibe la germination des spores et l’élongation des hyphes tout en modifiant la morphologie du champignon. Il perturbe également l’intégrité membranaire et aboutit à la libération du contenu intracellulaire, de façon non mécanique et sans agir directement sur la voie contrôlant l’osmorégulation. Par conjugaison avec le fluorophore BODIPY, nous avons révélé une affinité particulière de l’EDT151 pour l’enveloppe cellulaire et son internalisatio