The effects of p27Kip1 on the in vivo development and in vitro differentiation of mesencephalic dopaminergic neurons

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 26-05-2020Dopaminergic (DA) neuron development is a complex process, combining and coordinating the precise expression of numerous molecules. The importance of understanding this process is based on the growing interest in being able to reproduce their proper differentiation in vitro, in order to provide new treatment options for Parkinson’s Disease (PD). However, obtaining DA neurons that are biologically, chemically and physiologically equivalent to those found in the brain is a complicated process, and for that reason it is important to investigate how these neurons develop in their normal physiological context. We are investigating the role of the protein p27Kip1 (p27) in the differentiation process of these neurons. p27 is a cyclin/cyclin dependent kinase inhibitor (CKI) belonging to the Cip/Kip family of proteins. p27 is best known for its function in the cell cycle, where it specifically inhibits cyclin and cyclin dependent kinases (CDKs) of the G1 phase, and it is mainly regulated through controlling its degradation. However, in recent years, p27 has also been shown to have important implications outside of the cell cycle, including promoting primary neurogenesis in the cortex, inhibiting the transcription factor Sox2 and in promoting the differentiation of DA neurospheres. In the context of the ventral mesencephalon (VM), we see that p27 deficiency appears to have a specific effect on DA neuron production, significantly decreasing the early differentiation of these neurons in vivo and in vitro. Interestingly, these differences are accompanied by an increased pool of neural precursors, increasing Sox2 and Ngn2 expression. However, despite these increases, downstream targets of Ngn2 (such as NeuroD1) necessary to promote progenitor progression towards mature DA neuronal phenotypes are diminished. We therefore suggest a novel role of p27 in regulating proper cell cycle exit to promote appropriate activation of genes involved in neurogenesis. This knowledge would allow us to better apply the use of this protein to improve current differentiation protocols of DA neurons for stem cell replacement therapies in PDEl desarrollo de las neuronas dopaminérgicas (ND) es un proceso muy complejo, que combina la expresión de varias moléculas en un contexto muy específico. La importancia de entender este proceso se basa en el interés de reproducir el proceso de diferenciación in vitro, con el fin de buscar posibles terapias para la enfermedad de Parkinson (EP). Sin embargo, la obtención de ND in vitro, equivalentes a las del cerebro en relación a su biología, química y fisiología, es un proceso muy complicado y, por lo tanto, la investigación de cómo esas neuronas se desarrollan en su entorno normal es muy importante. Estamos investigando la función de la proteína p27Kip1 (p27) en la diferenciación de ND. p27 es un inhibidor de ciclinas/ciclinas dependiente de kinasas (CDKs) que pertenece a la familia de proteínas Cip/Kip. La función más conocida de p27 es el papel que juega en el ciclo celular, donde inhibe ciclinas y CDKs de la fase G1, y su regulación está mayormente controlada a través de su degradación. No obstante, se ha visto que p27 tiene funciones importantes fuera de su papel en el ciclo celular, como promover neurogénesis en la corteza cerebral, inhibir el factor de transcripción Sox2 (marcador de precursores neurales) y promover la diferenciación de neuroesferas de ND. En el contexto del mesencéfalo ventral (MV), hemos visto que la deficiencia de p27 tiene un efecto específico en la producción de las ND, disminuyendo de manera significativa la diferenciación de estas neuronas tanto in vivo como in vitro. Estas diferencias van acompañadas con un aumento en el numero de precursores neurales, aumentando la expresión de factores como Sox2 y Ngn2. Sin embargo, a pesar de ver un incremento en el número de precursores, dianas “downstream” de Ngn2, como sería el marcador NeuroD1 (que es necesario para promover la progresión de progenitores hacía ND maduras), está disminuido. Por lo tanto, nuestro trabajo sugiere un papel nuevo de p27 en la regulación del ciclo celular para promover y activar los genes necesarios para neurogénesis. Estos resultados podrían ser importantes para ayudar a mejorar los protocolos actuales de diferenciación de ND, y para futuras terapias de reemplazo celular en la E