Invetigation on the triterpenes yield of solid fermentation culture in Antrodia cinnamomea

牛樟芝為台灣特有真菌，本研究在探討牛樟菌固態平板生長速率及固態醱酵玻璃瓶培養之總三萜含量，為提升其生長速率與總三萜含量，使用不同的添加物與光源照射等方式刺激牛樟菌的生長與代謝；實驗結果顯示，固態平板以牛樟水配製之麥芽萃取物瓊脂培養基添加1%檸檬烯，可使牛樟菌培養時間由35天縮短至21天生長直徑就達到80.83±3.43 mm，生長速率可提升約2倍。 固態發酵以紅薏仁60克(浸泡在40克蒸餾水中)做為培養基質，添加濃度6%之麥芽萃取物經發酵培養後，總三萜含量為控制組之1.38倍；添加濃度1%之麥芽萃取物與0.5%大豆油經發酵培養後，總三萜含量為控制組之1.5倍；培養期間經紅色光源照射適當天數後總三萜含量可提升8.6%；綜合以上方法培養適當天數後可得最高總三萜含量約114.2±3.6 mg/g，樣品經50℃乾燥5天後重量僅剩原來的30±1%。Antrodia cinnamomea is a unique fungus in Taiwan. In this experiment, the growth rate and the triterpenes content of the solid state fermentation were discussed in order to enhance the fungal growth rate and the triterpenes content. Different additives and light sources were used to enhance the triterpenes content in A. cinnamomea. The experimental results show that the medium based on malt extract agar (prepared by Cinnamomum kanehirae water) along with 1% limonene, can make the culture time shorten from 35 days to 21 days with a growth diameter of 80.83 ± 3.43 mm, the growth rate was increased about 2-fold. When using 60g red coron (soaked in 40g water) as the basis solid state medium plus 6% malt extract, the triterpenes content can enhanced 1.38 fold compared to control (without malt extract). The medium with 1% malt extract and 0.5% soybean oil, triterpenes content could be increased to 1.5 fold compared to the control. The triterpenes content can be enhanced 8.6% by illumination with a red light source (light intensity= 10μm s-1m-2 ) for 14 days. Combination of the aforementioned methods, the highest triterpenes content of 114.2±3.6 mg/g was reached. The drying process was carried out in 50 ℃ for 5 days. The dried sample weights only 30±1% of the original one.中文摘要 i Abstract ii 目錄 iii 圖目錄 vi 表目錄 viii 第一章 緒論 1 1.1 前言 1 1.2 研究動機 1 第二章 文獻回顧 2 2.1 牛樟芝 2 2.1.1 簡介 2 2.1.2 培養方法 3 2.2 萜類(Triterpenoids)介紹 6 2.2.1 牛樟芝三萜類化合物 7 2.3 紅薏仁(Adlay) 8 2.4 粉頭(Wheat middlings) 8 2.5 添加劑(Additive) 8 2.5.1 α-松油醇(α-Terpineol) 8 2.5.2 大豆油(Soybean oil) 9 2.5.3 檸檬烯(Limonene) 10 2.5.4 幾丁聚醣(Chitosan) 11 2.6 Light-Emitting Diode (LED)之簡介 11 第三章 實驗材料與方法 12 3.1 藥品 12 3.2 設備 13 3.3 實驗菌株 14 3.4 實驗方法 14 3.4.1 固態平板菌株培養與繼代 14 3.4.2 液態搖瓶培養 15 3.4.3 固態玻璃瓶培養 16 3.4.4 固態平板最適化試驗 17 3.4.5 固態玻璃瓶培養最適化試驗 18 3.5 實驗分析 19 3.5.1 總三萜含量測定方法 20 3.5.2 HPLC檢測分析方法 21 第四章 結果與討論 22 Ⅰ.第一部分 固態平板培養試驗結果 22 4.1 不同瓊脂培養基質對生長情形之影響 22 4.1.1 不同小麥瓊脂培養基對生長速率之探討 22 4.1.2 粉頭不溶物過濾後瓊脂培養基對生長速率之探討 24 4.2 瓊脂培養基添加牛樟蒸餾水對生長情形之影響 25 4.2.1 麥芽萃取物瓊脂培養基添加牛樟水對生長速率之探討 25 4.2.2 粉頭瓊脂培養基添加牛樟水對生長速率之探討 27 4.3 不同瓊脂培養基添加甘胺酸對生長情形之影響 28 4.3.1 麥芽萃取物瓊脂培養基添加甘胺酸對生長速率之探討 28 4.3.2 粉頭瓊脂培養基添加甘胺酸對生長速率之探討 29 4.4 麥芽萃取物瓊脂培養基添加檸檬烯對生長速率之探討 29 4.5 麥芽萃取物瓊脂培養基添加大豆油對生長速率之探討 33 Ⅱ.第二部分 固態玻璃瓶培養試驗結果 36 4.6 固態培養基質對總三萜之影響 36 4.7 滅菌時間對總三萜之影響 37 4.8 酸鹼值對總三萜之影響 38 4.9 不同光源對總三萜之影響 39 4.9.1 紅色光源 39 4.9.2 藍色光源 40 4.9.3 綠色光源 41 4.9.4 黃色光源 42 4.10 添加劑於最適化培養基對總三萜之影響 44 4.10.1 各種添加物對總三萜之比較 44 4.10.2 添加不同濃度大豆油對總三萜之比較 45 4.10.3 添加不同碳源對總三萜之比較 46 4.10.4 添加不同濃度麥芽萃取物對總三萜之比較 47 4.10.5 添加1%麥芽萃取物與不同濃度大豆油對總三萜之比較 48 4.11 培養天數對總三萜之影響 49 4.12 樣品含水量之探討 51 4.13 HPLC圖譜分析 52 4.13.1 紅薏仁發酵前後萜類之差異 52 4.13.2 樣品萜類成分探討 53 4.13.3 添加不同添加物對萜類之影響 54 4.13.4 照射紅色光源對萜類之影響 56 第五章 結論與展望 57 5.1 結論 57 5.2 未來展望 58 參考文獻 59 附錄 6