Study on the optimal production and purification of antibacterial peptide mastoparan with various gene constructions

Mastoparan為一種從虎頭蜂身上萃取出的抗菌胜肽，在文獻中已證實具有殺死革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的效果，且對真核細胞的傷害極低，在抗菌藥物的生產上有很大的潛力。然而，如果直接從生物上萃取，不但量少而且成本昂貴，因此採用生物轉殖技術進行生物發酵，將可壓低生產成本並減少人力。 本研究利用基因工程的方法生產抗菌胜肽mastoparan，取用4種台灣常見虎頭蜂的mastoparan抗菌胜肽，MP-AF、MP-B、MP-D和MP-M，在蛋白上的N端和C端分別設計了chitin-binding-domain(CBD)和6個Histidine，期望以親和性吸附管柱CBD affinity tag column和poly his tag column來進行純化。然而mastoparan本身為毒蛋白，且實驗發現質體很不穩定，直接導致了蛋白表現量極低。因此我們採用了許多不同的誘導條件優化蛋白生產，探討出在誘導前加入營養物yeast extract並在生長對數期後期和15℃誘導，可以大大的提升可溶性蛋白產量20倍以上，純化前的目標蛋白(CBD-INT-MP-M-6His)的產量約為200mg/L，在大量的蛋白表現下，純化步驟會變得容易許多，以利於後續的研究。Mastoparan is an antimicrobial peptide extracted from the Vespa, which has the effect of killing Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi, and has very low damage to eukaryotic cells. It was of great potential for production of antimicrobial drugs. However, if directly extracted from the biological, the production amount will be small and expensive. The application of the gene transfer to the recombinant strain will be able to reduce the production costs. In this study, we use 4 kinds of mastoparan, i.e., MP-AF, MP-B, MP-D and MP-M, which were obtained from the venom of Vespa species in Taiwan. The fusion protein was constructed with its N-terminal designed with chitin-binding-domain plus ssp dnaB intein (CBD-INT) and and C-terminal with 6 histidines. In this way, the affinity adsorption columns such as CBD affinity tag column and poly his-tag column can be used for the mastoparans purification. Owing to the toxicity of mastoparans, the construction of plasmid is extremely unstable. The direct fusion protein expression is very low. Many different induction conditions were tried to optimize the soluble protein production. It was found that when yeast extract was added during the IPTG induction in the late logarithmic phase, the soluble protein yield could be enhanced more than 20 times, the target protein before purification (CBD- INT-MP-M-6His) is about 200 mg / L. The large amount of soluble proteins would facilitate the subsequent purification studies.摘要 i Abstract ii 目錄 iii 圖目錄 vi 表目錄 viii 一、緒論 1 二、文獻回顧 2 2.1 抗菌胜肽與抗生素 2 2.1.1 抗生素的發展與面臨之困境 2 2.1.2 抗菌胜肽的發展 2 2.1.3 抗菌胜肽mastoparan 3 2.2 表現系統 4 2.2.1 表現宿主比較 4 2.2.2 基因改殖 5 2.2.3 蛋白內含肽(intein) 5 2.3 純化策略 6 2.3.1 親和性純化法(His-tag) 7 2.3.2 親和性純化法(chitin-binding-domain) 8 2.3.3 Elastin-like Polypeptides (ELP) 9 2.4 蛋白質表現 10 2.5 質體不穩定性 11 2.6 抗Ampicillin(Amp)原理討論 12 三、實驗材料與方法 13 3.1 實驗菌株及質體來源 13 3.2實驗材料 13 3.2.1 PCR所用之 primer 13 3.2.2 實驗所用的藥品 14 3.2.3 實驗所用的生化試劑 15 3.2.4 實驗所用的配方 16 3.3實驗儀器及設備 19 3.4重組蛋白基因建構方法 20 3.4.1 primer設計 20 3.4.2 聚合酶鏈式反應 (polymerse chain reaction) 20 3.4.3 電泳跑膠基因確認 21 3.4.4 DNA切膠回收 21 3.4.5 基因黏合 21 3.4.6 勝任細胞制備 22 3.4.7 Heat shock transformation 22 3.4.8 transform後的PCR確認 23 3.4.9 質體抽取 23 3.4.10 基因剪切 23 3.5 大腸桿菌培養發酵 24 3.6 蛋白質分析 25 3.6.1 蛋白質sample製備 25 3.6.2 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) 26 3.6.3 Western blot analysis(西方墨點法) 26 3.7 蛋白質純化 27 3.7.1 6xHis resin 27 3.7.2 Chitin-binding-domain resin 29 3.8蛋白質定量(BSA法) 31 3.8.1 BSA檢量線製作 31 3.8.2 目標蛋白定量方法 32 3.9 蛋白質濃縮 32 3.10穩定性測試 32 四、結果與討論 34 4.1 質體確認 35 4.2 SDS-PAGE蛋白質表現確認 36 4.3 Western blot蛋白質表現確認 36 4.3.1 MP-M片段分別在ER2566與JM109的表現比較 36 4.3.2 四種接有6xHis的蜂毒蛋白表現比較 38 4.3.3 四種沒有接6xHis的蜂毒蛋白表現比較 40 4.3.4 蛋白表現整理 41 4.4 蛋白表現最適化研究 41 4.4.1 大腸桿菌不同對數生長時期誘導對表現量影響 42 4.4.2 在誘導時加入不同的添加物對蛋白質表現量的影響 46 4.4.3 培養前加入過量營養與誘導前加入額外營養物的比較 48 4.4.4 添加不同IPTG濃度對表現的影響 50 4.4.5 不同轉速與有無溝槽對表現的影響 52 4.4.6 不同誘導時間長度對表現量的影響 55 4.4.7 能增進表現量的添加物定量比較 58 4.4.8 不同誘導溫度對目標蛋白表現的影響 60 4.4.9 持續加入添加物是否能增進表現量 63 4.4.10 誘導條件最適化統整 64 4.5 使用column做親和性吸附來純化 66 4.5.1 使用His column來做純化吸附 66 4.5.2 使用CBD column來做純化吸附 68 4.6 質體穩定性測試 70 4.6.1 Amp在不同培養時間的效果 70 4.6.2 長時間培養後的質體穩定性 71 五、結論與未來展望 72 5-1結論 72 5-2未來展望 73 六、參考資料 74 圖目錄 Figure 1. 溫度變化對ELP的影響 9 Figure 2. 重組蛋白基因建構步驟示意圖 24 Figure 3. His-tag column機制示意圖 28 Figure 4. CBD column機制示意圖 30 Figure 5. BSA法蛋白質定量檢量線製作 31 Figure 6. 重組基因建構示意圖 34 Figure 7. 四種不同抗菌胜肽(MPs) PCR跑膠確認 35 Figure 8. 不同宿主的蜂毒蛋白表現比較 37 Figure 9. 蜂毒蛋白表現比較(含6His) 38 Figure 10. 蜂毒蛋白表現比較(含6His) 39 Figure 11. 四種不同不含His的蜂毒序列比較 40 Figure 12. 不同生長對數期比較 42 Figure 13. 不同生長對數期產量圖表 43 Figure 14. 不同生長對數期比較2 44 Figure 15. 不同生長對數期產量圖表2 45 Figure 16:不同誘導前添加物對目標蛋白表現量的影響 47 Figure 17:不同時機添加養分 48 Figure 18. 不同時機添加養分產量圖表 49 Figure 19:不同濃度IPTG對蛋白表現量的影響 50 Figure 20. 不同濃度IPTG對蛋白產量的影響圖表 51 Figure 21:不同轉速與錐形瓶對蛋白表現量的比較 53 Figure 22. 不同轉速與錐形瓶對蛋白產量的比較圖表 54 Figure 23: 不同誘導時間對表現量的影響 56 Figure 24. 不同誘導時間對蛋白產量的影響圖表 57 Figure 25: 能增進表現量的添加物定量比較 58 Figure 26. 能增進表現量的添加物產量比較圖表 59 Figure 27不同誘導溫度對目標蛋白表現的影響 61 Figure 28. 不同誘導溫度對目標蛋白產量的影響圖表 62 Figure 29 誘導過程中多添加營養物的影響 63 Figure 30. 誘導條件調整前後比較 65 Figure 31. 用His-tag做純化吸附 67 Figure 32. 使用CBD column來做純化吸附 69 Figure 33長時間培養後的質體穩定性比較 71 表目錄 Table 1. 台灣常見6種虎頭蜂的抗菌胜肽基因片段 3 Table 2. 不同表現宿主的比較 5 Table 3. 使用His-tag進行純化的抗菌胜肽文獻 7 Table 4. 使用chitin-binding-domain tag生產蛋白相關文獻 8 Table 5. PCR所用之 primer 13 Table 6. 實驗所用的藥品 14 Table 7. 實驗所用的生化試劑 15 Table 8. 實驗儀器及設備 19 Table 9. 不同基因構築之蛋白表現確認 41 Table 10. 不同生長對數期比較 43 Table 11. 不同生長對數期比較2 45 Table 12. 不同時機添加養分比較 49 Table 13. 不同濃度IPTG對蛋白表現量的影響 51 Table 14. 不同轉速與錐形瓶對蛋白表現量的比較 53 Table 15. 不同誘導時間對表現量的影響 57 Table 16. 能增進表現量的添加物定量比較 59 Table 17. 不同誘導溫度對目標蛋白表現的影響 61 Table 18. 誘導條件最適化統整 6