Development of versatile upconversion nanoparticles for near-infrared light-mediated photodynamic/photothermal therapies against cancer cells

為克服傳統光動力治療於深層組織療效不彰及提高治療效率，本研究以具能量升頻轉換功能的奈米粒子為光敏藥物的傳遞媒介。透過照射對組織具良好滲透性的近紅外光雷射，經能量升頻粒子轉換為特定波長的可見光活化光敏藥物，對癌細胞進行光動力/光熱複合治療。本研究開發的能量升頻粒子以NaGdF4的奈米結晶(nanocrystal)為核心，於其內部摻混入Yb3+/Er3+稀土元素，賦予奈米粒子將入射近紅外光能量升頻轉換成特定波長可見光之功能。製備出的奈米粒子再覆蓋上矽殼隔絕水分子與奈米粒子的表面溪土元素接觸後，能降低螢光猝滅情形。經由疏水作用力吸附上光敏藥物IR780(進行光熱治療)和十八烷基酯化玫瑰素(進行光動力治療)後，製備出的載藥奈米粒子粒徑約為50 nm。十八烷基酯化玫瑰素/IR780的藥物負載效率則分別為98%及47%。細胞實驗結果顯示，一旦對此奈米藥物傳遞系統照射808和980 nm的近紅外光雷射，可有效活化癌細胞內奈米粒子對癌細胞(CT26)進行光熱/光動力複合治療。In order to enhance the therapeutic efficacy of photodynamic therapy (PDT) in the deep tissues, the functionalized silica-coated upconversion nanoparticles (SiO2@UCNPs), Er3+/Yb3+-doped NaGdF4, were utilized as a drug nanocarrier capable of efficiently delivering photosensitizers, octadecane-modified rose bengal (18CRB, for PDT) and IR780 (for photothermal therapy (PTT)), into cancer cells for the PDT/PTT combination therapies. After being shielded with silica shell, the significant luminescence quenching behavior caused by the high energy vibrations between water species and rare-earth cations can be pronouncedly reduced. The drug-loaded UCNPs exhibits a mono-model size distribution with a ca 50 nm in particle size. The drug loading efficiencies of 18CRB and IR780 were 98 and 47 %, respectively. In vitro cytotoxic data demonstrate that with the 808-nm laser irradiation, the viability of cancer cells (CT26) incubated with 18CRB/IR780-loaded UCNPs was largely reduced due to the PTT-induced hyperthermia. Furthermore, combing the 980-nm laser irradiation, the cell apoptotic behavior could be further enhanced due to the PDT reaction activated by the specific visible light converted from the incident laser light by UCNPs. Our results demonstrate a promising combination effect of PTT and PDT against cancer cells.致謝 II 中文摘要 III ABSTRACT IV 目錄 V 圖目錄 VIII 表目錄 XI 一、文獻回顧與研究動機 1 1.1. 研究背景與文獻回顧 1 1.1.1. 升頻發光奈米粒子(upconversion nanoparticles, UCNPs)發展背景 1 1.1.2. 升頻發光奈米粒子的介紹 2 1.1.3. 升頻發光機制 5 1.1.4. 升頻發光奈米粒子的製備方法 7 1.1.5. 升頻發光奈米粒子的特性與檢測及成像應用 10 1.1.6. 光動力療法 14 1.1.7. 光熱療法 18 1.1.8. 升頻發光奈米粒子的生物醫療應用 20 1.2 研究動機與目的 23 二、實驗藥品與儀器 25 2.1 實驗藥品 25 2.2 實驗儀器 25 三、實驗方法 26 3.1 油酸-上轉換發光奈米粒子的製備與基本性質分析 26 3.1.1. 製備油酸-上轉換發光奈米粒子(NaGdF4:20%Yb,2%Er) 26 3.1.2. 油酸-上轉換發光奈米粒子基本性質分析 26 3.2 疏水化修飾玫瑰素的製備與性質檢測 27 3.2.1 製備疏水化修飾玫瑰素[33] 27 3.2.2 十八烷基酯化玫瑰素(Octadecyl Rose Bengal Ester, 18CRB)分析 27 3.3 油酸升頻發光奈米粒子之親水性修飾─二氧化矽包覆 27 3.3.1. 製備二氧化矽-升頻發光奈米粒子(SiO2@UCNP) 27 3.3.2. 二氧化矽-升頻奈米粒子負載光熱(IR780)/光動力(18CRB)藥物的製備 28 3.3.3. 二氧化矽-上轉換發光奈米粒子基本性質分析 28 3.3.4. 光動力/光熱效果測試 28 3.4 體外細胞實驗 29 3.4.1 細胞株及培養方式 29 3.4.2 細胞毒性分析 29 3.4.3 光動力/光熱現象 30 四、結果與討論 31 4.1 油酸-升頻發光奈米粒子 31 4.1.1 Ln3+/Na+比例效應 31 4.1.2 反應溫度效應 32 4.1.3 反應時間效應 33 4.1.4 最適化油酸-升頻發光奈米粒子 35 4.2 十八烷基酯化玫瑰素分析 37 4.3 二氧化矽包覆升頻發光奈米粒子(SIO2@UCNP) 40 4.3.1 二氧化矽包覆升頻發光奈米粒子的基本分析 40 4.3.2 二氧化矽-升頻發光奈米粒子負載光熱/光動力藥物 42 4.4 細胞實驗 45 4.4.1 細胞毒性分析 45 4.4.2 光動力/光熱現象於細胞影像 46 五、結論 49 六、參考文獻 50 圖1升頻發光奈米粒子的生物性應用[2] 2 圖2 摻雜離子對主體晶格的影響方式示意圖：相同價數離子的摻雜影響(a)離子較小(b)離子較大；不同價數離子的摻雜影響(c)與額外離子作電荷補償形成替代與間隙佔領(d)與空位佔領結合的補償替代(e)較小的離子所產生的間隙佔領[10]。 4 圖3上轉換發光的基本機制示意圖[3] 5 圖4 鐿/鉺系統的能量圖譜[12] 6 圖5 (左圖)升頻發光奈米粒子核殼結構示意圖[3](右圖)核式與核殼式粒子在水相中的螢光強度[22]。 10 圖6 活細胞的螢光影像：卵巢癌細胞(OVCAR3, 上列)、腺癌細胞(HT29, 下列)；由左至右分別是白光影像→暗室影像→重疊影像[23]。 11 圖7 大鼠螢光影像：量子點注射在半透明皮膚的腳(a)表現出螢光，但無法通過皮膚較厚的背部(b)或腹部(c)；升頻發光奈米粒子注射在腹部皮膚(d)、大腿肌肉(e)、背部(f)中表現出螢光[23]。 12 圖8基於螢光共振能量轉移分析法，系統示意圖[24] 13 圖9 基於磁生物分離的分析方法，偵測微量DNA的示意圖[25] 14 圖10 光動力治療產生活性氧物質的反應方式[28] 16 圖11光動力治療誘導免疫抑制的機制[29] 17 圖12 不同溫度下熱治療效果示意圖[30] 19 圖13 光熱作用的基本測試 (a)升溫曲線：水(黑色)、升頻發光奈米粒子-氧化鐵奈米複合材料(紅色)、多功能奈米粒子(藍色)給予808奈米雷射照射 (b)不同修飾的多功能奈米粒子有無808奈米雷射照射下對於人類鼻咽癌細胞(KB cell)的細胞毒性結果 (c)細胞實驗的上轉換螢光奈影像：將多功能奈米粒子(PEG-MFNP)與細胞共培養並利用外加磁場控制奈米粒子的累積區域，利用980奈米雷射激發藉由 in vivo imaging system 取得螢光影像。插圖為實驗裝置圖 (d-f)利用共軛交螢光影像偵測經過施予磁靶性的光熱治療後分別為靠近磁鐵、中間及遠離磁鐵的螢光染色影像(calcein AM(綠色,活細胞)；propidium iodide(紅色,死細胞) (g)磁靶性光熱治療後經trypan blue染色後培養皿數碼照片 (h-j)光學顯微鏡下不同區域的影像[31] 21 圖15 (a)四個組別經過光動力治療後第14天的照片 (b)腫瘤體積的生長曲線 (c)為組別1經光動力治療24小時後，腫瘤組織切片的TUNEL免疫染色螢光顯微影像。TUNEL：細胞凋亡；DAPI：細胞核；上轉換螢光：上轉換發光奈米粒子；比例尺為20微米。 (d)將螢光顯微影像中TUNEL的螢光強度數值化的統計圖表，代表不同組別的細胞凋亡程度。[32] 22 圖16 本研究示意圖 24 圖17 鈉離子濃度效應(左圖)奈米粒子晶型-X光繞射圖譜(右圖)波長980奈米雷射激發下，升頻螢光圖譜。 31 圖18 升頻奈米粒子穿透式電子顯微影像。鈉離子/鑭系離子比例下粒徑變化a: 10:1(6.03 nm±0.33)、b: 2.5:1(5.89 nm±1.32)、c: 1:1(4.07 nm±0.26) 32 圖19 反應溫度效應(左圖)奈米粒子晶型-X光繞射圖譜(右圖)波長980奈米雷射激發下，升頻螢光圖譜。 33 圖20升頻奈米粒子穿透式電子顯微影像。不同反應溫度下的粒徑變化a:300 ℃(6.03 nm±0.33)、b: 320 ℃(8.43 nm±0.76)、c: 280 ℃(4.46 nm±0.48) 33 圖21反應時間效應(左圖)奈米粒子晶型-X光繞射圖譜(右圖)波長980奈米雷射激發下，升頻螢光圖譜。 34 圖22升頻奈米粒子穿透式電子顯微影像。不同反應溫度下的粒徑變化a:30 min(6.03 nm±0.33)、b: 60 min(5.81 nm±0.41)、c: 90 min(5.86 nm±0.53) 34 圖24 (左圖)升頻發光光譜，以近紅外光980奈米雷射激發。插圖：暗室/亮室下激發影像(右圖)激發光源與螢光強度對數-對數圖。插圖：不同激發強度下螢光圖譜。 36 圖25 鐿/鉺系統能量激發示意圖 36 圖26 18CRB之(左圖) 1H-NMR氫譜(右圖)化學結構式 37 圖27 產物(18CRB)及反應物(18CBr、RB)之核磁共振氫譜對照 38 圖28產物(18CRB)及反應物(18CBr、RB)之紅外光光譜 39 圖29 十八烷基酯化玫瑰素在辛醇/磷酸緩衝液系統中的UV圖譜(左圖) pH7.4緩衝液(右圖) pH4.7緩衝液 40 圖30 (左圖)二氧化矽包覆升頻奈米粒子之X光繞射圖譜及(右圖)穿透式電子顯微影像 41 圖31 SiO2@UCNP與OA-UCNP的升頻螢光圖譜。8 mg/mL，980奈米雷射功率為1.5W 42 圖32 (左圖)熱影像圖。以808奈米近紅外光激發藥物IR-780 (右圖)光熱升溫曲線圖 43 圖33 IR780負載前/後吸收紅移圖譜 43 圖34 玫瑰素(RB)/十八烷基玫瑰素(18CRB)吸收圖譜 44 圖35 DPBF檢測單態氧生成柱狀圖。980奈米近紅外光雷射，雷射強度1.0W。 44 圖36 空載體/18CRB/IR780細胞存活率 45 圖37-1 CT26 cells與空載體/雙藥載體共培養後，以近紅外光觸發光動力/光熱作用，並以Hoechst 33342(藍)、PI(紅)與SOSG(綠)進行多重染色觀察光動力/光熱在細胞層級上的作用。 47 圖37-2 CT26 cells與空載體/雙藥載體共培養後，以近紅外光觸發光動力/光熱作用，並以Hoechst 33342(藍)、PI(紅)與SOSG(綠)進行多重染色觀察光動力/光熱在細胞層級上的作用。 48 圖38 (左圖)PI訊號計數 (右圖)SOSO畫素量化。兩者皆以純細胞作為基準值做數據處理，故純細胞訊號值皆為1。 48 表1.基材/聲子能量對應表[3]