Development of Portable Electrochemical Device for Rapid Detection of Pesticide Residues by AChE Inhibition

農藥在農業生產中的好處包括提高糧食生產率和控制病媒，但是不當及過量使用可能會影響人類健康風險和環境污染。現有的標準農藥殘留定量檢測法，是使用不同層析法搭配質譜儀聯進行檢測，具高敏感度及高準確性的優點。但此方法有檢測時間長、價格昂貴、操作繁雜、需專業人員操作及機台龐大等缺點。在本研究中，利用酶被抑制特性，我們開發了一種快速農藥檢測儀，具有快速、便宜實惠、操作簡單和便於攜帶的優點。酶抑制法是利用有機磷類和氨基甲酸鹽類農藥對於乙醯膽鹼酯酶（AChE）活性的抑制能力，並藉由循環伏安法（CV）和微分脈衝伏安法（DPV）進行測量。實際樣品量測方法是將蔬菜和水果切成1cm×1cm的尺寸大小樣品，將樣品浸入碘化乙醯硫代膽鹼（ATCI）和磷酸鹽緩衝溶液（PBS）的混合物中進行製備。接著將樣品滴在可拋棄式金電極上進行電化學測量。 在農藥檢測中，對於陶斯松及加保利為0.1~2ppm的範圍量測，具靈敏度高，檢出極限低等優點。陶斯松的線性回歸方程為y = -17.999x + 166.93，R2值為0.978。 加保利的線性回歸方程為y = -12.578x + 172.23，R2值為0.967。本研究還測定了大白菜和蘋果的農藥殘留。小白菜中陶斯松的回收率分別為81％和111％，而蘋果中陶斯松的回收率分別為85％和116％。小白菜中加保利的回收率分別為75％和92％，蘋果中加保利的回收率分別為90％和72％。實驗結果表明，可攜帶式農藥殘留檢測儀可以對陶斯松和加保利進行簡單靈敏的檢測。Benefits of pesticides use in agriculture include improving food productivity and controlling vector disease. But, inadvertent exposure to pesticides may affect human health risk and environment contamination such as water, soil and air contamination. Current standard quantitative testing for pesticide residue uses chromatographic methods combined with mass spectrometry with high sensitivity and accuracy. However, chromatographic methods are time consuming, expansive, labor intensive and requirement of precise equipment. In this study, we developed a portable pesticide residue detector based on enzymatic methods which have advantages of rapid, affordable, simple to operate and requirement of portable equipment. Enzymatic methods based on the inhibition of acetylcholinesterase (AChE) activity by the action of organophosphorus and carbamate pesticides were used and AChE activity was measured by cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV). A portable electrochemical potentiostat was used to perform CV and DPV. Vegetables and fruits were sliced in 1cm x 1cm and were immersed in the mixture of acetylcholine iodide (ATCI) and phosphate buffered saline (PBS) for sample preparation. Samples were then dropped on the disposable gold electrodes for electrochemical measurement. The Chlorpyrifos and carbaryl were measured from 0.1~ 2ppm with good sensitivity and low detection limit. The linear regression equation for chlorpyrifos is y= -17.999x+166.93 with an R2 value of 0.978. The linear regression equation for carbaryl is y= -12.578x+172.23 with an R2 value of 0.967. The pesticide residues of Chinese cabbage and apples were also measured in this study. The recovery rates for chlorpyrifos in Chinese cabbages were 81% and 111% and in apples were 85% and 116%. The recovery rates for carbaryl in Chinese cabbages were 75% and 92% and in apples were 90% and 72%. Experimental results show the portable pesticide residue detector can perform simple and sensitive detections to chlorpyrifos and carbaryl.誌謝 i 摘要 ii Abstract iii 目錄 iv 圖目錄 vii 表目錄 ix 第一章、前言 1 1.1. 研究動機 1 1.2. 農藥 1 1.2.1 農藥分類 1 1.2.2 作用藥理機制 7 1.2.3 作用機制與抗藥性 7 1.2.4 毒性敘述及中毒症狀 9 1.3. 農藥殘留檢測方法 10 1.3.1質譜檢測技術 10 1.3.2層析檢測技術 11 1.3.3光譜檢測技術 11 1.3.4免疫分析法檢測技術 12 1.3.5酶抑制法檢測技術 12 1.4. 電化學法檢測農藥殘留 13 1.4.1與酶抑制法結合使用之農藥檢測殘留 13 1.4.2利用具有電化學活性之農藥直接檢測 16 1.5. 生物感測器(biosensor) 18 1.6. 研究目標 19 1.7. 論文架構 19 第二章、相關理論與技術 20 2.1.電化學 20 2.1.1 電化學質傳與電子交換現象 20 2.1.2 電極程序之動力學 22 2.1.3 界面現象與電極雙層模型 24 2.1.4 電化學量測方式 26 2.1.5 循環伏安法(Cyclic Voltammetry) 27 2.1.6微分脈衝伏安法(Differential Pulse Voltammetry) 30 2.2. 網印平面電極(Screen-printed electrode, SPE) 33 2.2.1 網印平面電極製作 34 2.3. 酵素簡介與固定方法 35 2.3.1 酵素特性 35 2.3.2 酵素固定法 37 第三章、實驗材料與方法 40 3.1. 拋棄式金電極製作 40 3.1.1 PCB電極底板設計與製作 40 3.1.2 網印對電極與參考電極 42 3.1.3 酵素接附區的設計與製作 44 3.2. 電化學感測器硬體設計 44 3.2.1 電路原理設計 44 3.2.2 硬體外型設計 45 3.3. 實驗藥品與設備 47 3.3.1 藥品試劑與儀器設備 47 3.4. 藥品溶液配置 47 3.4.1酵素配置分裝 47 3.4.2配製對氧磷標準品 48 3.4.3配製碘化乙醯硫代膽鹼標準品 48 3.5. 電化學檢測分析 48 3.5.1三極式電極 48 3.5.2電化學參數與操作 49 3.5.3 實際樣品分析 49 第四章、 結果與討論 50 4.1. 捨棄式晶片金電極 50 4.2. 可攜帶式電化學儀 50 4.3. 分析方法 51 4.3.1 農藥電化學快速分析方法 51 4.3.2 與國內現有農藥快速分析方法比較 53 4.4. 標準農藥檢測方法 53 4.4.1 循環伏安法量測AChE反應ATCI之氧化/還原電位 53 4.4.2 AChE活性及受質ATCI濃度對抑制率影響 55 4.4.3 電解質pH影響 57 4.5. 酵素電極製備 58 4.5.1 AChE酵素電極固定接附方式 58 4.5.2 酵素固定電極穩定性測試 60 4.6. 微分脈衝伏安法參數調整 62 4.6.1 DPV 最佳化條件探討 62 4.6.2循環伏安法與微分脈衝伏安法比較 65 4.7. 實際樣品分析 66 4.7.1市售農藥抑制曲線 66 4.7.2實際檢測分析 69 4.7.3實際樣品添加測定 71 第五章、結論與未來展望 72 5.1 結論 72 參考文獻 7