Development of Foxtail mosaic virus as a VIGS vector

近年陸續多種植物基因體已完成解序，包括水稻、大麥、小麥、二穗短柄草、阿拉伯芥及番茄等。為了進行植物功能性基因體的研究，利用病毒誘導基因靜默技術(virus-induced gene silencing, VIGS)可在短時間內快速靜默目標基因。由於病毒感染植物後，在植物上會造成嵌紋斑點或條斑狀的病徵並影響植物生長發育，不利於研究。本研究使用的病毒為狐尾草嵌紋病毒(Foxtail mosaic virus, FoMV)，FoMV全長為6,161個核苷酸，隸屬Potexvirus屬。FoMV寄主範圍甚廣，主要感染禾本科植物，包括現行主要糧食作物，因此將FoMV開發成VIGS系統，有利於糧食作物的基因體研究。在前人研究中，將FoMV之鞘蛋白啟動子序列重複構築，插入目標基因片段誘導植物發生基因靜默現象，開發過程包括探討目標基因序列的限制長度，及發展雙基因靜默系統，以避免發生基因靜默後卻沒有明顯的表觀變化。其中當FoMV感染二穗短柄草後，病毒在植物會造成褐色條斑狀病徵，並且在短時間內就會死亡；而FoMV感染大麥後，病徵表現上雖不似二穗短柄草嚴重，但仍然不利於觀察。有報導指出病徵表現與病毒的外鞘蛋白有關，因此本研究將針對FoMV的鞘蛋白進行突變。透過外鞘蛋白N端刪減序列後並接種到白藜與二穗短柄草觀察病徵表現，刪減5到9個胺基酸之突變株皆能於這兩種植物感染並複製，其中接種突變株pCFNd8及pCFNd9在二穗短柄草上的生長趨勢較不受影響外，病徵表現也弱於野生株。將此二突變株開發成VIGS載體並接種到白藜與二穗短柄草，pCFSDNd8及pCFSDPDSIRNd8可感染這兩種植物，但pCFSDPDSIRNd9則無法感染。另外也透過error-prone PCR進行外鞘蛋白突變，並建立突變庫，期望得到弱病毒株，以利進一步作為VIGS載體系統及外源蛋白表現系統等多元用途。Recently, genomes of many plants, including rice, barley, wheat, Brachypodium distachyon, Arabidopsis thaliana and tomato have been completely sequenced. With these powerful database, scientists can focus on the genes they interested. Virus-induced gene silencing (VIGS) is one of the important tool which has been used for plant functional gene studies based on the high knockdown efficiency. During viral infection, the symptoms on plants are not only mosaic, spots and strips, but the interference of plant growth. Foxtail mosaic virus (FoMV) has a 6,161 nt positive sense genome and belongs to the Potexvirus genus, which infects a wide range of hosts, especially the Poaceae comprising crops. Thus FoMV is worthy for establishing as a VIGS system. Previous studies have constructed a serial of FoMV derived vectors which carrying the repeat sequence of FoMV coat protein promoter for gene silencing. However, the clones cause severe symptoms that we can't distinguish the phenotype resulting from the VIGS. Previous studies had shown that Potexvirus coat protein involves in the symptom expression. In this study, we have modified FoMV coat protein N terminal by deletion of 5 to 9 amino acids. The resulting mutants can infect Chenopodium quinoa and B. distachyon. B. distachyon inoculated with pCFNd8 and pCFNd9 did not show the negative growth effects, and induced milder symptom or than wild type FoMV did. The pCFSDNd8 and pCFSDPDSIRNd8, which carries no-inserted sequence and inverted repeat PDS partial sequence respectively, can infect and replicate in C. quinoa and B. distachyon, but pCFSDPDSIRNd9 is non-infectious. We also use error-prone PCR to creat the CP mutant library of FoMV, for further development of a more effective VIGS vector or platform for expressing exogenous protein.中文摘要 i 英文摘要 ii 壹、前言 1 一、病毒誘導基因靜默系統(Virus-Induced Gene Silencing, VIGS) 1 二、VIGS在禾本科植物上的研究 2 三、狐尾草嵌紋病毒 4 四、二穗短柄草 5 五、外鞘蛋白與病徵的關係 6 六、研究目的 7 貳、材料與方法 8 一、構築外鞘蛋白N端刪減序列之狐尾草嵌紋病毒質體 8 二、構築重複外鞘蛋白次基因體啟動子於外鞘蛋白N端刪減之狐尾草嵌紋病毒質體 8 三、易錯聚合酶連鎖反應(Error-prone PCR) 9 四、大腸桿菌勝任細胞製備及轉形作用 9 五、狐尾草嵌紋病毒質體純化 10 (一)、聚合酶連鎖反應 10 (二)、質體小量純化 10 (三)、質體中量純化 11 (四)、菌種保存 12 六、植物接種狐尾草嵌紋病毒 12 (一)、供試植株 12 (二)、接種測試 12 七、植物總量蛋白質抽取與分析 12 (一)、萃取植物總量蛋白 12 (二)、聚丙醯胺膠體電泳 13 (三)、西方轉漬法 13 (四)、西方墨點法(dot blot) 14 參、結果 15 一、植物接種測試 15 (一)、狐尾草嵌紋病毒外鞘蛋白N端刪減序列株接種Chenopodium quinoa之測試 15 (二)、狐尾草嵌紋病毒外鞘蛋白N端刪減序列株接種Brachypodum distachyon (Bd 21-3)之測試15 (三)、狐尾草嵌紋病毒接種Bd21-3之病徵表現16 二、外鞘蛋白N端刪減8個及9個胺基酸之狐尾草嵌紋病毒誘導基因靜默(VIGS)載體系統之接種測試 16 (一)、構築FoMV重複外鞘蛋白次基因體啟動子(duplicated CP sgRNA promoter)於CP N端刪減病毒重組株 16 (二)、外鞘蛋白N端刪減序列之狐尾草嵌紋病毒VIGS載體接種白藜16 (三)、外鞘蛋白N端刪減序列之狐尾草嵌紋病毒VIGS載體接種Bd 21-3 17 三、建立狐尾草嵌紋病毒外鞘蛋白N端隨機突變株庫 17 (一)、構築隨機突變株 17 (二)、突變株接種測試 18 肆、討論 19 伍、參考文獻 22 陸、圖表與附錄 2