Generation of Three Recombinant D78 Infectious Bursal Disease Viruses and Purification with Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography

傳染性華氏囊病病毒 (Infectious bursal disease virus, IBDV) 主要感染3-7週齡幼雞華氏囊的未成熟B淋巴細胞，造成雞隻免疫系統受抑制並進一步感染其他疾病而死亡，此疾病造成了家禽業重大的經濟損失。先前研究指出，IBDV的殼蛋白VP2具有抗原決定位並與IBDV的致病性及誘導宿主產生中和性抗體等有關係。在病毒SVP (subviral particles) 的研究中，暴露在病毒顆粒外側的VP2 His253為主要能吸附Ni-NTA的胺基酸殘基，為了發展能夠利用固定化金屬離子親和性層析 (Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography, IMAC) 管柱純化IBDV病毒顆粒之技術，利用反向遺傳學將IBDV rD78病毒將根據軟體計算病毒顆粒表面暴露面積較大之數個胺基酸位置以組胺酸進行單點突變而得到重組病毒rD78-Q221H、-P222H和-Q324H。首先利用DF-1及Vero細胞株比較IBDV在細胞株之病毒增殖效率，以不同病毒感染劑量 (multiplicity of infection, MOI) 100、10-1、10-2的條件下感染細胞，在感染後不同時間點觀察細胞病變效應 (cytopathic effect, CPE) 及病毒增殖情形。在以0.01 MOI感染時，DF-1與Vero細胞在感染後第3天與第6天時能增殖病毒達力價106 pfu/mL與105 pfu/mL，在DF-1細胞IBDV的複製效率較高，因此後續以DF-1細胞感染病毒0.01 MOI為條件大量生產病毒及純化。在各組突變重組病毒的病毒力價均較低，無法上升至如rD78-WT的106 pfu/mL，而實驗中的所有重組病毒的VP2、VP3蛋白都能利用IMAC Ni-NTA管柱純化，其中以rD78-P222H的VP2蛋白最為集中於pH 4.0沖提出來。Infectious bursal disease virus (IBDV) causes severe immunosuppression in 3-7 week-old young chickens by infecting B cells in the bursa of Fabricius and thus causes severe damages to their immune systems. The immunosuppressive diseases will enable the IBDV-infected chickens more susceptible to other infectious agents leading to death. The IBDV infection usually results in tremendous economic loss in poultry industry. Previous study reveals that the capsid protein VP2 of IBDV contains neutralizing epitopes of IBDV and plays an important role in virulence, as well as antigenic variation. Recently, we concluded that the exposed residue His253 of a VP2-formed subviral particle (SVP) is crucial for the binding affinity of SVP to Ni-NTA. In order to develop a method for the purification of IBDV using immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC), the recombinant D78 (rD78) IBDV with site-directed mutagenesis rD78-Q221H, -P222H, and -Q324H were generated and characterized. The mutant sites were calculated and predicted to be exposed at the surface of virions. Initially we compared the efficiency of IBDV replication levels in DF-1 cells and Vero cells by infecting IBDV at the multiplicities of infection (MOI) of 1, 0.1 and 0.01. Our results indicated that at 0.01 MOI the virus could be amplified up to 106 pfu/mL at 3 days post-infection (dpi) in DF-1 cells, and 105 pfu/mL at 6 dpi in Vero cells. Therefore, following we propagated recombinant viruses by infecting DF-1 cells with 0.01 MOI while the rD78 mutants couldn't amplify as much as rD78-WT. The virus solutions were further purified by IMAC. The recombinant virus VP2 and VP3 proteins could be purified by Ni-NTA column, among all of them rD78-P222H is mostly centralized eluted at pH 4.0.中文摘要 i Abstract ii 目錄 iii 第一章 文獻回顧 1 ㄧ、傳染性華氏囊病毒 (Infectious Bursal Disease Virus) 1 （一）傳染性華氏囊病之簡介 1 （二）IBDV的構造與基因組及其產物 1 （三）病毒的增殖 2 二、反轉遺傳技術 (Reverse Genetics) 3 三、固定化金屬離子親和性層析 4 第二章 研究動機 6 第三章 材料方法 7 一、細胞與病毒 7 （一）傳染性華氏囊病毒 7 （二）DF-1細胞 7 （三）Vero細胞 7 二、 細胞培養 7 （一）解凍細胞 8 （二）細胞繼代 8 （三）冷凍細胞 8 三、 重組病毒的製備 9 （一）重組質體的製備 9 （二）重組質體的放大 9 （三）共轉染 (Co-Transfection) 9 （四）病毒RNA之定序 10 四、病毒力價測定 10 五、病毒測定增殖條件測試 11 六、病毒增殖 11 七、以固定化金屬離子親和性管柱純化病毒 11 八、聚丙烯醯胺膠體電泳 (SDS-PAGE) 11 九、Coomassie blue染色 12 十、西方墨點法 (Western blot) 12 十一、以穿透式電子顯微鏡觀察純化後之病毒顆粒 12 第四章 結果 14 一、病毒增殖條件測試 14 （一）細胞的生長 14 （二）病毒感染力價 14 （三）含血清及無血清培養細胞感染病毒力價 15 二、rD78 IBDV病毒共轉染 15 （一）純化重組質體 15 （二）共轉染 16 （三）病毒繼代 16 三、rD78 IBDV病毒純化 16 （一）以固定化金屬離子親和性層析純化病毒 16 （二）IMAC 純化結果之分析 17 四、以穿透式電子顯微鏡觀察病毒顆粒 17 第五章 討論 18 一、細胞進行感染與其增殖病毒力價之關係 18 二、反轉遺傳單點突變病毒之病毒力價關係 19 三、IMAC 純化重組病毒之差異 19 四、病毒生產和病毒純化的增進方法與未來的研究應用 20 五、未來的研究應用 21 第六章 參考資料 23 第七章 結果圖表 30 第八章 附錄 4