The synergistic effect of AGUAAA motif and poly(A) tail on the polyadenylation of coronavirus

冠狀病毒 (Coronavirus)為具有封套，正股的RNA病毒，基因體大小約26.4 kilobase (kb)至31.7 kb，是目前已知最大的RNA病毒。位於真核細胞mRNA 3'UTR內的AAUAAA序列，為多腺苷酸化 (polyadenylation)之重要訊號；由於冠狀病毒其基因體的結構類似真核細胞的mRNA，而我們在betacoronavirus的3'UTR也發現序列AAUAAA和類似的序列AGUAAA。為了探討牛冠狀病毒AGUAAA序列是否參與其多腺苷酸化，我們利用牛冠狀病毒的天然缺陷株RNA (defective interfering RNA, DI RNA)，將其AGUAAA突變並給予不同長度poly(A) tail，構築一系列的DI RNA突變株，再將這些突變株轉染至Human rectal tumor cell-18 (HRT-18)細胞，利用head-to-tail ligation、RT-PCR及定序方法偵測病毒正股基因體poly(A) tail長度之變化。由實驗結果可知 (i) AGUAAA序列參與牛冠狀病毒之多腺苷酸化作用。(ii) 當牛冠狀病毒具有15到20個核苷酸長的poly(A) tail，即便AGUAAA序列被突變，仍然具有多腺苷酸化作用之能力。(iii) 對於牛冠狀病毒而言，同時保有AGUAAA序列和足夠長度 (15到20個核苷酸長)的poly(A) tail，會比只單獨具有AGUAAA序列或15到20個核苷酸長的poly(A) tail之突變株具有較高效率的多腺苷酸化作用。因此，根據本研究結果推測，牛冠狀病毒其多腺苷酸化作用之機制可能為：當病毒在生成新的正股病毒基因體時，需藉由AGUAAA序列吸引參與多腺苷酸化作用的蛋白質結合，以進行poly(A) tail的生成作用。Coronavirus is an enveloped, positive-sense, single-stranded RNA virus, with the largest genome size of 26.4 kilobase (kb) to 31.7 kb among the known RNA viruses. The AAUAAA motif located in the 3'UTR of eukaryotic mRNA is an important signal for polyadenylation. Since the genome structure of coronavirus is similar to that of eukaryotic mRNA and the AAUAAA motif or its variation AGUAAA is also similarly found in the 3'UTR of betacoronaviruses, we hypothesized that the AGUAAA sequence may play an important role in coronavirus polyadenylation. For this, we employed coronavirus defective interfering RNA (DI RNA) to construct a series of AGUAAA mutants with different length of poly(A) tail, and the mutated DI RNA was then transfected into Human rectal tumor cell (HRT-18 cell). The length of poly(A) tail was determined by head-to-tail ligation followed by RT-PCR and sequencing. The results were as follows: (1) the AGUAAA sequence was involved in coronaviral polyadenylation. (2) Coronavirus with the length of 15 to 20 nucleotides (nts) poly(A) tail still maintained the polyadenylated ability even though the AGUAAA motif was mutated. (3) The synergy of AGUAAA motif and at least 15 to 20-nts of poly(A) tail has the best efficiency for the polyadenylation of coronavirus during infection. Therefore, based on the results we propose that the coronavirus polyadenylation occurs during positive-strand RNA synthesis and involves the AGUAAA motif and related proteins.中文摘要………………………………………………………………………………i 英文摘要………………………………………………………………………………ii 目次…………………………………………………………………………………...iii 表次…………………………………………………………………………………....v 圖次…………………………………………………………………………………...vi 第一章 前言…………………………………………………………………………..1 第二章 文獻探討……………………………………………………………………..2 第一節 真核細胞mRNA之多腺苷酸化作用 (Polyadenylation)……………..2 1.1 多腺苷酸化作用-poly(A) tail之生成…………………………………2 1.2 細胞核的多腺苷酸化作用…………………………………………….2 1.3 細胞質的多腺苷酸化作用…………………………………………….3 1.4 真核細胞mRNA多腺苷酸化作用之功能…………………………...3 第二節 病毒的多腺苷酸化作用………………………………………………..4 第三節 冠狀病毒之介紹………………………………………………………..4 3.1 冠狀病毒之分類……………………………………………………….4 3.2 冠狀病毒所引起之疾病……………………………………………….5 3.3 冠狀病毒基因體之結構……………………………………………….5 第四節 Poly(A) tail在冠狀病毒中所扮演的角色……………………………..6 第五節 冠狀病毒天然缺陷株之介紹…………………………………………..6 5.1 冠狀病毒天然缺陷株之種類………………………………………….6 5.2 牛冠狀病毒天然缺陷株之介紹……………………………………….7 第六節 冠狀病毒基因體有類似真核細胞poly(A) tail形成所需要的基因序 列………………………………………………………………………..7 第三章 材料與方法…………………………………………………………………..9 第一節 病毒與細胞……………………………………………………………..9 1.1 病毒與細胞…………………………………………………………….9 1.2 細胞之繼代…………………………………………………………….9 第二節 牛冠狀病毒基因體3'端突變之DI RNA之構築……………………..9 2.1 以重疊聚合酶連鎖反應構築DI RNA 3'端突變株.…….……………..9 第三節 DNA片段之轉殖與增殖……………………………………………10 3.1 將突變的DNA片段送入Topo載體內進行轉殖…………………10 3.2 以聚合酶連鎖反應進行突變菌落之篩選…………………………...11 3.3 細菌質體之增殖以及質體DNA萃取………………………………11 3.4 限制酶切割以及溶膠試驗純化DNA片段…………………………12 3.5 以T4 DNA Ligase將DNA片段連接……………………………….12 3.6 將突變的DNA片段送入pGEM-3Zf(-)載體內…………………….13 3.7 以聚合酶連鎖反應進行突變菌落之篩選…………………………...13 3.8 細菌質體之增殖以及質體DNA萃取………………………………13 3.9 以聚合酶連鎖反應構築DI RNA 3'端不同長度的poly(A) tail……13 第四節 體外轉錄以及RNA定量…………………………………………….14 4.1 體外轉錄……………………………………………………………...14 4.2 純化RNA…………………………………………………………….14 4.3 Denature gel之配製以及RNA定量…………………………………14 第五節 牛冠狀病毒3'端突變的DI RNA之轉染……………………………15 5.1 病毒與細胞…………………………………………………………...15 5.2 DI RNA之轉染………………………………………………………..15 第六節 以反轉錄聚合酶連鎖反應和定序分析偵測正股poly(A) tail之生合 成………………………………………………………………………16 6.1 從HRT-18細胞中萃取RNA………………………………………...16 6.2 基因體5'端頭帽(cap)之去除………………………………………...16 6.3 利用T4 RNA Ligase將3'末端和5'頭端連接………………………16 6.4 以反轉錄聚合酶連鎖反應偵測正股DI RNA……………………….17 6.5 將反轉錄聚合酶連鎖反應產物進行定序…………………………...17 第四章 結果…………………………………………………………………………18 第一節 牛冠狀病毒於感染過程中，AGUAAA序列在冠狀病毒多腺苷酸化作用之重要性…………………………………………………………18 第二節 在牛冠狀病毒感染過程中，如有15-20個nt長的poly(A) tail存在時，即使AGUAAA序列被突變，仍能保有多腺苷酸化的能力….19 第三節 在牛冠狀病毒感染過程中，AGUAAA序列以及poly(A) tail的長度均會影響冠狀病毒poly(A) tail的形成……………………………...20 第五章 討論…………………………………………………………………………22 參考文獻...…………………………………………………………………………...3