Study on population diversity of medicinal fungus Sanghuangporus sanghuang by using ISSR molecular markers

桑黃隸屬於擔子菌門 (Basidiomycota)、刺革菌目 (Hymenochaetales)、刺革菌科 (Hymenochaetaceae)、桑黃屬 (Sanghuangporus)，為重要藥用真菌。藉由採集自中國、日本、韓國以及台灣地區37株桑黃子實體或菌種，應用分析Internal transcribed spacer rDNA (ITS，包含ITS1、5.8S、ITS2)片段、Large subunit rDNA (28S rDNA)、Mitochondrial Small rDNA (MS)基因片段以及簡單重複序列 (Inter-Simple Sequence Repeat, ISSR)分子標誌，進行族群遺傳及物種起源路徑探討研究。 初步分析Internal transcribed spacer rDNA (ITS，包含ITS1-5.8S-ITS2)、Large subunit rDNA (28S rDNA)與Mitochondrial Small rDNA (MS)基因片段，所得結果顯示，由於序列間變異性不足，這些基因片段不適合用來研究桑黃族群分化。因此，本研究採用ISSR分子標誌技術進行這項研究。從100條ISSR引子中篩選出產生增幅條帶具多型性且再現性良好的6條引子。利用6條ISSR引物進行PCR試驗，每一引物擴增獲得的ISSR條帶數在3 ~ 14條之間，擴增片段集中在300 bp ~ 3,000 bp。基於遺傳相似性系數（GSt）、基因流 (Nm)、不加權成對群算術平均法（UPGMA）構建的譜系樹分析。結果顯示，同一族群樣本間的遺傳分化較小，不同地域的樣本間存在著較大的遺傳多樣性。分子變方分析 (AMOVA) 結果顯示，華西南、華中-華東南-台灣與華東北-韓國-日本產之桑黃區域間的變方成分為74％，而區域內族群間之變方成分為68％。不分區域之族群間的變方成分為65%，近二倍於族群內個體間的變方成分（35%）。顯示族群個體之變異主要來自族群間。族群遺傳分析POPGENE結果顯示族群具有中偏低之基因歧異度值 (H為0.1679)、較高之遺傳分化 (Gst為0.5129)及較低基因流 (Nm為0.4748)，這現象顯示族群基因流受到限制，地區之間有交流障礙，受地理阻礙，與地理分布狀況相關，因此有中等偏低的基因歧異度與較高分化之遺傳結構。桑黃族群的遺傳距離矩陣及地理距離矩陣所進行相關性測驗，結果顯示桑黃之族群變異與地理距離有顯著關係。根據基因組多態性分析及歸群分析，四川、西藏的遺傳多樣性分別為0.1139、0.1132，高於其它地區，推測四川、西藏有較古老祖先型桑黃。依據族群遺傳變異之歸群與主座標分析結果，可將桑黃區分為華西南、華中-華東南-台灣與華東北-韓國-日本三個族群。各地族群之分化應該是受地理阻隔的影響。中文摘要........i Abstract........ii 目錄........iv 表目錄........vii 圖目錄........viii 第一章、前言........1 第二章、前人研究........3 1.桑黃簡介........3 1. 1.桑黃分類........3 1. 2.桑黃名稱........3 1. 3.桑黃生長、形態特徵及功效........3 1. 3. 1.桑黃生長及形態特徵........3 1. 3. 2.桑黃功效........4 2.桑黃歷史分類與其近緣物種........5 2. 1.桑黃歷史分類........5 2. 2. Sanghuangporus 針對此屬的物種描述........6 2. 2. 1.高山桑黃S. alpinus........6 2. 2. 2.環區桑黃S. zonatus........6 2. 2. 3.暴馬桑黃/暴馬子S. baumii........6 2. 2. 4.小孔忍冬桑黃S. lonicericola........6 2. 2. 5.大孔忍冬桑黃S. lonicerinus........6 2. 2. 6.楊樹桑黃/楊黃S. vaninii........7 2. 2. 7.錦帶花桑黃S. weigelae........7 2. 2. 8.小囊桑黃S. microcystideus........7 2. 2. 9.韋爾桑黃S. weirianus........7 3.桑黃寄主生長調查........7 4.ITS、28S、MS序列分析在真菌研究應用........9 5.DNA分子標誌在藥用真菌研究應用........12 5. 1.RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphisms）....12 5. 2.RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)........12 5. 3.AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)........13 5. 4.ISSR (Inter-Simple sequence repeat)........14 第三章、材料與方法........15 1.研究材料........15 1. 1.ITS、28S、MS實驗樣品........15 1. 2.ISSR實驗樣品........17 2.試劑及藥品........18 3.儀器設備........19 4.實驗方法........19 4. 1.核酸萃取........19 4. 2.引子（primer）的選用........20 4. 2. 1.ITS引子試驗........20 4. 2. 2.28S引子試驗........20 4. 2. 3.MS引子試驗........20 4. 2. 4.ISSR引子試驗........20 4. 3.聚合酵素鏈反應........21 4. 3. 1.ITS、28S、MS設定........21 4. 3. 2.ISSR設定........22 4 .3. 3.檢驗PCR擴增結果........23 5.資料分析........23 5. 1.ITS、28S、MS分析........23 5. 2.ISSR分析........24 5. 2. 1.分子性狀記錄 (molecular traits record)........24 5. 2. 2.樣本間之遺傳相似度 (genetic similarity)........24 5. 2. 3.AMOVA分析 (analysis of molecular variance)........24 5. 2. 4.遺傳分化差異分析 (population genetic)........25 5. 2. 5.歸群分析 (cluster analysis)........25 5. 2. 6.主座標分析 (Principal Coordinate Analysis, PCA)....25 5. 2. 7.遺傳距離矩陣及地理距離矩陣之關聯測驗 (Mantel test)........25 第四章、結果........26 1.桑黃樣品調查........26 2.利用ITS、28S、MS分子標誌於桑黃樣品分析........26 3.利用ISSR分子標誌於桑黃樣品分析........30 3. 1.歸群分析結果........30 3. 2.AMOVA分析 (analysis of molecular variance) 結果......30 3. 3.遺傳分化差異分析 ( population genetic) 結果......33 3. 4.歸群分析 (cluster analysis) 結果........35 3. 5.主座標分析 (principal coordinates analysis, PCA) 結果........38 3. 6.遺傳距離矩陣及地理距離矩陣之關聯測驗 (Mantel test) 結果........40 第五章、結果........41 第六章、討論........42 參考文獻........45 附錄........5