The genetic study of human serotonin receptor gene HTR1A in woman menopause symptom and pro-inflammatory cytokines

更年期（Menopause）是女性生命中一個自然的變化，代表著週期性經期與生育期的結束。在更年期期間，婦女的卵巢停止生產卵子，產生的雌激素和黃體激素也跟著減少。許多婦女受苦於荷爾蒙失衡引起的更年期症狀。更年期常見的症狀包括：逐漸減少並最終停止月經，熱潮紅，皮膚發紅，頭痛，泌尿生殖道萎縮，萎縮性陰道炎等等；其中，熱潮紅是最常被更年期婦女提及的一種症狀。另一方面，更年期荷爾蒙的變化也導致了人體生理和代謝的改變，因此可能產生肥胖、代謝與發炎的問題，困擾著更年期的女性。雌激素是女性體內最主要的一種性荷爾蒙，調節了人體許多生理與病理作用，影響遍及全身。因此當荷爾蒙失調，可能會導致多種神經傳遞物質，例如血清素的不平衡，造成更年期症狀產生。人體中有兩個獨立的血清素系統存在，分別為神經和周邊系統。我們認為，血清素對更年期症狀可能扮演了重要但複雜的角色；而關於體溫調節與代謝發炎的反應，可能取決於血清素對特定血清素受體的刺激。遺傳關聯研究是一種策略，目前常常被用於研究人體一些複雜症狀的表現。在本篇研究中，我們探討血清素受體1A基因（HTR1A）在更年期症狀中扮演的角色，HTR1A是一個會受到荷爾蒙激素調控的候選基因，並被認為可能與體溫調節和代謝發炎有關。為了要檢查HTR1A是否參與了台灣更年期女性產生熱潮紅症狀和代謝的改變，我們選定四個HTR1A的單核?酸多型性（SNP）位點，運用101位更年期婦女的DNA，並以SNP關聯性分析、連鎖不平衡分析與單型（haplotype）關聯性分析去研究HTR1A和熱潮紅風險之間的關聯。此外，我們還評估更年期女性其代謝發炎相關細胞因子的水平，並使用獨立樣本T檢定、單因子變異數分析等統計方法，分析HTR1A SNPs與代謝和發炎之間的關聯。綜合上述之研究，我們發現位在HTR1A編碼區的SNPs在對照組與病例組分布之不同，還有SNP的不同基因型影響細胞因子濃度之關聯性。這些成果在在提示了HTR1A應該扮演了某種角色並參與更年期症狀的產生，值得進行後續研究，以期了解HTR1A影響更年期症狀的詳細機制。Menopause is marked by the permanent absence of menstruation, and is a natural change of a woman's life. During menopause, a woman's ovaries stop making eggs and they produce less estrogen and progesterone. Many women suffer from menopause symptoms that caused by hormonal imbalance. Common symptoms of menopause include: menstrual periods that occur less often and eventually stop, hot flashes, skin flushing, headaches, irregular heartbeat, urogenital atrophy, atrophic vaginitis and obesity. Hormonal changes during menopause also led to a change in the human physiology and metabolism. Genetic association study is a strategy that has currently been suggested for mapping complex symptoms. In this study, we propose to study specific gene that might be related to hot flashes, the most common problems in women of menopause, by using candidate gene approach. Reduction in estrogen concentrations could result in imbalances of various neurotransmitters, such as serotonin, resulting in the sensation of hot flashes and metabolic disorder. Serotonin receptor 1A gene (HTR1A) is one of the leading candidate genes for hormone related thermoregulation and metabolism. To examine if HTR1A is involved in menopause hot flashes, metabolism and pro-inflammatory in Taiwanese, SNPs of HTR1A have been selected to analysis the association between HTR1A and hot flashes risk by single SNP association, linkage disequilibrium analysis and haplotype association study in 101 menopausal women. We also assess some related cytokine serum levels in menopause women, and apply independent-sample T-test and one-way analysis of variance(ANOVA) to further study the association between HTR1A polymorphisms with metabolism and pro-inflammatory. Summarize above studies, we found that the SNP at HTR1A coding region are different distribution between the control group and the case group, as well as different SNP genotypes association with cytokine concentration. These outcomes suggested HTR1A should play in a certain role and participate in the generation of menopausal symptoms, worth further to research the mechanism.目錄 摘要 ......i Abstract ......ii 目錄 ......iii 圖目錄 ......v 表目錄 ......vi 補充資料目錄 ......viii 一、 前言 ......1 （一） 更年期 ......1 1. 更年期症狀 ......1 （二） 荷爾蒙 ......3 1. 雌激素 ......3 2. 雌激素與熱潮紅 ......4 3. 雌激素與更年期相關之代謝發炎現象 ......4 4. 雌激素失衡的影響 ......8 （三） 血清素系統 ......8 1. 血清素 ......8 2. 血清素系統 ......9 3. 血清素受體 ......9 4. 血清素受體1A基因 ......10 5. HTR1A的功能性與分布 ......10 （四） 血清素系統與更年期症狀 ......11 1. HTR1A與體溫調節 ......11 2. 血清素系統與代謝發炎的變化 ......12 （五） 遺傳變異 ......13 1. 單核?酸多型性 ......13 2. 單型 ......14 3. 標籤SNP ......14 （六） 連鎖不平衡 ......14 （七） 哈代—溫伯格平衡（哈代—溫伯格定律） ......15 （八） 遺傳關聯研究 ......15 二、 材料與方法 ......17 （一） 實驗材料 ......17 1. 藥品試劑 ......17 2. 儀器設備、器材 ......18 （二） 實驗方法 ......19 1. 臨床樣本收集 ......19 2. 候選基因與SNP標記的選擇 ......19 3. DNA製備 ......20 4. HTR1A SNPs基因分型 ......21 5. 細胞因子（cytokine）濃度檢測 ......21 6. 統計分析 ......22 三、 實驗結果 ......23 （一） HTR1A SNPs的Hardy-Weinberg 平衡檢定 ......23 （二）HTR1A單一位點的Case-Control遺傳關聯分析 ......23 （三） HTR1A SNPs 的連鎖不平衡分析 ......24 （四） HTR1A haplotype與熱潮紅的關聯分析 ......24 （五） HTR1A SNPs的基因型和對偶基因與細胞因子之關聯分析 ......24 （六） HTR1A的haplotype與細胞因子之關聯分析 ......25 （七） HTR1A功能性元件分析 ......25 四、 討論 ......27 （一） HTR1A SNPs和haplotype與熱潮紅的關聯分析 ......27 （二） SNP rs1800042與HTR1A的功能性 ......28 （三） 雌激素、雌激素受體與HTR1A ......28 （四） HTR1A與細胞因子關聯分析 ......29 （五） 結論 ......29 五、參考文獻 ......70 圖目錄 圖 一、熱潮紅與代謝發炎研究樣本篩選流程 ......30 圖 二、HTR1A SNPs在HTR1A基因上相對位置圖 ......31 圖 三、HTR1A上游DNA序列雌激素受體結合位分析。 ......32 表目錄 表 一、本研究之HTR1A 四個目標SNP s詳細資訊 ......33 表 二、HTR1A 基因SNP s在對照組與熱潮紅病例組的 Hardy-Weinberg 平衡檢定 ......34 表 三、HTR1A 基因SNP s在正常對照組與自發性熱潮紅病例組的 Hardy-Weinberg 平衡檢定 ......35 表 四、HTR1A 基因SNP s在乳癌患者的對照組與誘發性熱潮紅病例組的 Hardy-Weinberg 平衡檢定 ......36 表 五、HTR1A 基因SNP s在對照組與熱潮紅患病例組的遺傳關聯分析 ......37 表 六、HTR1A 基因SNPs在正常對照組與自發性熱潮紅病例組的遺傳關聯分析 ......38 表 七、HTR1A 基因SNPs在乳癌患者的對照組與誘發性熱潮紅病例組的遺傳關聯分析 ......39 表 八、HTR1A基因SNPs在對照組與熱潮紅病例組的 Pair-wise Linkage Disequilibrium a（D'） ......40 表 九、HTR1A 基因SNPs在正常對照組與自發性熱潮紅病例組的 Pair-wise Linkage Disequilibrium a（D'） ......41 表 十、HTR1A 基因SNPs在乳癌患者的對照組與誘發性熱潮紅病例組的 Pair-wise Linkage Disequilibrium a（D'） ......42 表 十一、HTR1A 基因SNPs在對照組與熱潮紅病例組的 Haplotype關聯分析 ......43 表 十二、HTR1A 基因SNPs在無乳癌者的正常對照組與自發性熱潮紅病例組的 Haplotype關聯分析 ......44 表 十三、HTR1A 基因SNPs在乳癌患者的對照組與誘發性熱潮紅病例組的Haplotype關聯分析 ......45 表 十四、細胞因子adiponetin與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......46 表 十五、細胞因子resistin與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......47 表 十六、細胞因子insulin與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......48 表 十七、細胞因子leptin與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......49 表 十八、細胞因子IP-10與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......50 表 十九、細胞因子MCP-1與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......51 表 二十、細胞因子MIP-1-beta與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......52 表 二十一、細胞因子IL-10與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......53 表 二十二、細胞因子IL-1b與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......54 表 二十三、細胞因子IL-8與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......55 表 二十四、細胞因子TNF與HTR1A SNPs的基因型與對偶基因之關聯分析 ......56 表 二十五、細胞因子adiponetin與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......57 表 二十六、細胞因子resistin與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......58 表 二十七、細胞因子insulin與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......59 表 二十八、細胞因子leptin與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......60 表 二十九、細胞因子IP-10與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......61 表 三十、細胞因子MCP-1與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......62 表 三十一、細胞因子MIP-1-beta與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......63 表 三十二、細胞因子IL-10與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......64 表 三十三、細胞因子IL-1b與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......65 表 三十四、細胞因子IL-8與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......66 表 三十五、細胞因子TNF與HTR1A SNPs的haplotype之關聯分析 ......67 補充資料目錄 補充資料 一、血清素的合成路徑與分子結構(Druce, Rockall et al. 2009) ......68 補充資料 二、G蛋白偶聯受體（GPCR）結構(Kiran Panesar, BPharm et al.) ......6