Xanthomonas campestris pv. glycines 噬菌體 ϕXcg25 之分離與分析

Xanthomonas campestris pv. glycines (Xcg) is a Gram-negative plant pathogenic bacterium causing pustules in susceptible soybean cultivars. Phages are virus that specifically infect bacteria, in which lytic phages can cause host cells death. So far, no Xcg phage has been reported. In this study, 4 lytic phages of Xcg, designated as ϕXcg6L, ϕXcg15L, ϕXcg25L and ϕXcg25S, were isolated from 28 environmental samples. Results of restriction analysis of the genomic DNA and profiling of the virion proteins in SDS-polyacrylamide gel indicated that these phages are of the same type. Phage ϕXcg25S which exhibited the strongest lysis ability was selected for further study. Electron microscopy revealed that ϕXcg25 possesses the typical morphology of a siphovirus, with a hexagonal head (65 X 60 nm) and a long non-contractile tail (193 nm in length). ϕXcg25 can infect Xcg12609 and Xcg12620 but not Xcg strain YR32, E. coli and P. aeruginosa. A phage titer reaching 1.0 x 1011 PFU/ml can be produced upon infecting rapidly growing Xcg12609. After being stored at 4 oC for 12 months, about 54% of the phage particles were found to retain infectivity. Testing of host lysis ability showed that complete lysis of Xcg12609 can be achieved by infecting at an MOI of 0.01, but no apparent lysis was observed on Xcg12620 by infecting at an MOI of 10. Host lysis was enhanced in the presence of 10 mM MgSO4 supplemented, indicating that Mg2+ is required for the lysis of host cells by ϕXcg25. In adsorption test, 10% of the phage particles was found to be adsorbed at 10 min, with the adsorption rate reaching 60% at 60 min. One step growth assay suggested that ϕXcg25 has a latent period and burst size of approximately 45 min and 150 PFU per infected cell, respectively. Sequencing revealed that the ϕXcg25 genome consists of 43,221 bp with a G+C content of 54.9%. Of the 56 ORFs identified, 33 are similar to known proteins which can be classified into four different functional categories (lysis, head, tail and DNA replication/repair), 18 are similar to hypothetical proteins, and 5 find no homologues in database. Similarity analysis showed that proteins of ϕXcg25 shares an average identity of 85 %, 77% and 65% with those from P. aeruginosa phage vB_Pae-Kakheti25 (PA25), P. aeruginosa phage 73 (PA73), and Burkholderia phage KL1 (KL1), respectively. In addition, the tail related proteins of ϕXcg25 showed an average identity of 34.5% and 35.3% to those of YuA-like phage YuA and M6, respectively. ϕXcg25 is similar to many P. aeruginosa phages but it cannot infect P. aeruginosa indicating that the major host anti-receptor is significantly different. Further efforts are required for developing ϕXcg25 into a biological agent for control of bacterial pustules in soybean.Xanthomonas campestris pv. glycines (Xcg) 為革蘭氏陰性植物病原菌，主要宿主為豆科植物。Xcg 感染宿主植物後會引發葉燒病，造成經濟損失。噬菌體為專一感染細菌之病毒，其中之溶裂型噬菌體感染宿主後，會導致菌體裂解死亡。目前尚未有 Xcg 噬菌體之文獻被發表。本實驗從28 個自然環境樣本中分離到 4 株可以感染 Xcg 之溶裂型噬菌體，分別命名為 ϕXcg6L、ϕXcg15L、 ϕXcg25L、ϕXcg25S。依據限制酶切割圖譜與 SDS-PAGE 分析結果，推測此四個噬菌體分離株可能屬於同一類型。因此挑選其中感染力最強的噬菌體 ϕXcg25S (以下稱為 ϕXcg25)，進一步分析。在電子顯微鏡下觀察 ϕXcg25 外型，具有六角形頭部 (65 X 60 nm)，以及較長不可收縮的尾部構造 (193 nm in length)。依外型特徵分類， 屬於 Siphoviridae 科。寄主範圍測試結果顯示，噬菌體 ϕXcg25 除了可感染 Xcg 12609 外，亦可感染 Xcg 12620，但無法感染 Xcg YR32、E. coli 及 Pseudomonas aeruginosa。噬菌體 ϕXcg25 感染 Xcg 12609 後，效價最高約為 1.0 x 1011 PFU/ml。於 4 ̊C 冰箱中儲存 12 個月後，噬菌體效價值約為原效價的 54%，其半衰期約為 12 個月。以 MOI = 0.01 之噬菌體感染 Xcg 12609 即可觀察到明顯溶裂情形；但以 MOI = 10 之噬菌體感染 Xcg 12620則未有明顯裂解效果。於培養液中加入 10 mM 的 MgSO4 可幫助噬菌體溶裂宿主並增加噬菌體效價。吸附能力測試結果顯示，噬菌體感染宿主 10 分鐘後，只有約 10% 噬菌體吸附於細胞上，至 60 分鐘時約有 60 % 噬菌體吸附；one-step growth assay 結果，噬菌體 ϕXcg25 之 latent period約為 45 分鐘，burst size 約為 100 PFU/cell。噬菌體 ϕXcg25 基因體大小為 43,221 bp，G+C content 為 54.9%，包含 56 個 ORFs；其中 33 個 ORFs 可比對到已知蛋白質，依功能可分成溶裂、頭部組裝、尾部組裝以及複製、重組和修復相關蛋白質，18 個 ORFs 比對到 hypothetical protein，其餘 5 個 ORFs 則未比對到任何相似的蛋白質。NCBI blastx 比對結果發現噬菌體 ϕXcg25 基因產物與P. aeruginosa phage vB_Pae-Kakheti25 (PA25)、P. aeruginosa phage 73 (PA73) 及 Burkholderia phage KL1 (KL1) 具高度相似性，平均相同度分別為 85 %、77% 與 65%。另外，ϕXcg25與 YuA-like 噬菌體 YuA 及 M6 只有尾部相關蛋白質相似，相同度分別為 34.5% 及 35.3%。ϕXcg25 與多株 P. aeruginosa 噬菌體相似，但卻不能感染 P. aeruginosa，代表其辨認宿主之構造有差異。未來期能發展成 ϕXcg 生物藥劑，專一殺滅宿主 Xcg ，達到防治葉燒病的效果。摘要………………………………………………………………………i Abstract……………………………………………………………iii 目錄………………………………………………………………………v 縮寫字對照表…………………………………………………………viii 前言………………………………………………………………………1 材料………………………………………………………………………5 一、 菌種、噬菌體及質體…………………………………………5 二、 藥品……………………………………………………………5 三、 酵素……………………………………………………………5 四、 抗生素使用濃度………………………………………………5 五、 培養基…………………………………………………………6 (一) 液體培養基……………………………………………………6 (二) 固體培養基……………………………………………………6 六、 試劑及緩衝溶液………………………………………………6 (一) 抽取質體 DNA 試劑…………………………………………6 (二) 抽取噬菌體 DNA 之試劑……………………………………6 (三) DNA 電泳試劑…………………………………………………7 (四) SDS-聚丙烯醯胺凝膠試劑……………………………………7 方法………………………………………………………………………9 一、 細菌之培養與保存……………………………………………9 (一) 細菌之培養……………………………………………………9 (二) 細菌之保存……………………………………………………9 二、 噬菌體的篩選…………………………………………………9 (一) 樣品的處理……………………………………………………9 (二) 噬菌體的分離…………………………………………………9 (三) 噬菌體的純化…………………………………………………10 三、 噬菌體之增殖與保存…………………………………………10 四、 溶菌圈點測試 (spot test) ………………………………10 五、 Plaque assay…………………………………………………10 六、 噬菌體 DNA 之抽取…………………………………………11 七、 洋菜膠電泳分析 (agarose gel electrophoresis)………12 八、 SDS 聚丙醯胺凝膠蛋白質電泳分析 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) ……12 (一) SDS-PAGE 之製配…………………………………………12 (二) 電泳分析及染色………………………………………………12 九、 電子顯微鏡樣品製備…………………………………………13 十、 生長曲線測定…………………………………………………13 十一、 噬菌體吸附測試………………………………………………13 十二、 單步生長曲線 (one step growth curve) 測試…………14 十三、 小量質體 DNA 之抽取………………………………………14 十四、 質體之選殖……………………………………………………15 (一) 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction，PCR) …15 (二) 限制酶切割 (Restriction enzyme digestion) …………15 (三) DNA 片段之回收………………………………………………15 (四) DNA 之黏接反應 (Ligation) ………………………………16 十五、 轉形作用 (transformation) ………………………………16 (一) E. coli 勝任細胞 (competent cell) 之製備…………16 (二) E. coli 之轉形作用 (transformation) ………………17 十六、 DNA 定序………………………………………………………17 結果……………………………………………………………………18 一、 Xcg 菌株之基本生理特性……………………………………18 二、 Xcg 噬菌體之分離與純化……………………………………18 (一) 噬菌體的篩選………………………………………………18 (二) 噬菌體分離株之初步篩選……………………………………19 三、 噬菌體ϕXcg25 之特性分析…………………………………19 (一) 噬菌體ϕXcg25 之外型………………………………………19 (二) 噬菌體ϕXcg25 最佳效價 (titer) ………………………19 (三) 噬菌體ϕXcg25 之穩定性……………………………………20 (四) 寄主範圍 (Host range) ……………………………………20 (五) ϕXcg25感染不同宿主之生長曲線、菌體存活率及噬菌體效價…21 (六) Mg2+ 對於噬菌體 ϕXcg25 感染宿主之影響……………23 (七) 噬菌體 ϕXcg25 之吸附率…………………………………25 (八) 噬菌體 ϕXcg25 之 one-step growth assay……………25 四、 Xcg噬菌體 ϕXcg25 之核酸分析……………………………25 (一) 噬菌體 ϕXcg25 之限制酶切割圖譜………………………25 (二) 噬菌體 ϕXcg25 基因體定序………………………………26 (三) 噬菌體 ϕXcg25 基因體之 ORFs 組成……………………26 (四) 噬菌體 ϕXcg25 不同類型基因分析………………………27 1. 噬菌體ϕXcg25 之溶裂相關基因……………………………28 2. 噬菌體ϕXcg25 之結構基因…………………………………29 3. 噬菌體 ϕXcg25 之複製、重組和修復相關基因…………30 4. 其他…………………………………………………………31 討論…………………………………………………………………32 一、 噬菌體 ϕXcg25 之特性分析………………………………32 二、 噬菌體ϕXcg25 之核酸分析…………………………………34 (一) 噬菌體 ϕXcg25 基因體之 ORFs 組成……………………34 (二) 噬菌體ϕXcg25 之溶裂相關基因……………………………35 (三) 噬菌體ϕXcg25 之結構基因…………………………………37 (四) 噬菌體 ϕXcg25 之複製、重組和修復相關基因…………39 (五) 其他……………………………………………………………41 參考文獻………………………………………………………………43 圖表………………………………………………………………………4