The functional and structural characterizations of Cation/Proton Antiporter CpaA and c-di-AMP

二級訊號分子cyclic bis-(3',5')- dimeric adenosine monophosphate (c-di-AMP)為近幾年的研究中被發現廣泛存在於細菌和古生菌中，微生物會利用這類的二級訊號分子去反應外界的刺激以調控各種反應 。在過去的文獻中得知Staphylococcus aureus 中的CpaA (cation proton antiporter A)的C端 RCK (Regulator of Conductance of K+) domain為能辨識c-di-AMP ，而根據其在不同菌種裡的homologous protein NapA, NhaA 推測主要功能為調控細胞內之Na+濃度及pH值，但目前並不清楚c-di-AMP 如何調控 CpaA 的功能。 目前已知CpaA為細菌細胞膜上的Na+/H+陽離子反向通道蛋白，N端為穿膜區域，而C端的RCK domain又分為RCK_N與RCK_C兩個區域，其中的RCK_C是與 c-di-AMP 結合的區域。在本篇實驗中，我們以全長之CpaA 跟 c-di-AMP 結合後所產生的功能和結構構形變化為目標，將建構膜蛋白的C端接上GFP(Green fluorescent protein) 和His-Tag，讓目標蛋白 CpaA 跟GFP一起被表現，便可以從whole cell 的狀況下觀測GFP的螢光強度去估計 CpaA 的表現狀況。我們更換了數種 E. coli 菌株和更營養的培養基，成功塞選出適合的培養方式。之後將 純化的CpaA 蛋白reconstitute到liposome裏面模擬蛋白質在細胞膜上的狀況進行功能性測試，並使用Pyranine 這種對pH 敏感的螢光染劑，將染劑包埋在 liposome 內部，在鈉或是鉀濃度梯度存在的狀況下去監控pH的變化。我們發現在 c-di-AMP 存在的情況下，CapA 轉運Na與K+的效率會有所提升。根據FSEC (Fluorescence Size Exclusion Chromatography)篩選能讓CpaA最能穩定存在的detergent為DM ( n-Decyl-β-D –Maltopyranoside)，期望之後能以此條件得到蛋白質晶體，提高以x-ray繞射得到高解析度之晶體結構的機會。Cyclic-di-AMP, a new type of second messenger, has been found abundant in bacteria and archaea in recent years. Microbes utilize the signaling molecule to mediate physiological function in response to external stimuli. A previous study shows that CpaA (cation proton antiporter A) in Staphylococcus aureus contains a C-terminal RCK (regulator of Conductance of K+) domain which can recognize c-di-AMP. RCK domain is composed of RCK_N and RCK_C subdomains and it has been confirmed that it is the RCK_C subdomain specifically interacts with c-di-AMP. The N-terminal domain of CpaA is a transmembrane region which is homologous to cation proton antiporter family, such as NapA and NhaA. Sequence analysis shows that Asp171 of CpaA, which is highly conserved in Caton Proton Antiporter (CPA) family, is believed to be involved in antiporter activity. It is thus assumed that CpaA can receive the signal of c-di-AMP and thus mediate cytosolic sodium concentration and pH values. However, the signaling mechanism is not well characterized. In this study, we aim to study the functional and structural mechanism of full-length CpaA. We constructed an expression vector with GFP fused at the C-terminus of target protein. This GFP-fusion improves the throughput of overexpression condition screening by measuring the whole cell fluorescence counts of GFP. We have successfully purified CpaA using DM detergent. We then reconstituted purified CpaA into liposomes containing a pH-sensitive fluorescence dye, pyranine, and characterized the mechanism of sodium or potassium concentration gradient regulated cation/proton translocation. We found that CpaA can transport sodium/potassium and protons in antiparallel fashion, and the exchange activity is further activated in the presence of c-di-AMP.中文摘要 I Abstract II 目次 III 圖目次 VII 第一章 前言 2 一、 新型的二級訊號分子c-di-AMP 2 二、 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)與c-di-AMP 3 三、 S. aureus 中c-di-AMP的受體蛋白CpaA 4 四、 本論文研究目的 6 第二章 材料與方法 7 一、 基因重組與轉殖 7 1. 全長SaCpaA之DNA序列取得 7 2. 引子設計 7 3. 聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR) 8 4. DNA膠體電泳 10 5. 純化全長CpaA DNA片段 10 6. 質體DNA-GFPe之抽取 11 7. 以接合酶連接重組DNA 11 8. 製備勝任細胞 12 9. 轉殖作用(transformation) 13 10. 以Colony-PCR確認接合狀況 13 11. 全長CpaA基因定序 14 二、 膜蛋白之大量表現與純化 14 1. 全長CpaA之小規模表現條件篩選 14 2. 膜蛋白之大量表現 15 3. 以FSEC篩選適合目標蛋白之detergent 16 4. 從細胞膜上萃取全長CpaA 17 5. 以Ni-NTA親和性管柱純化目標蛋白 17 6. 以膠體過濾法純化目標蛋白 18 7. 蛋白質濃度測定 19 三、 Proteioliposome製備與全長CpaA之功能性測定 19 1. Liposome製備流程 19 2. Proteoliposome製備:reconstitution 目標蛋白至liposome 20 3. 包埋對pH質敏感之螢光染劑於liposome內部 20 4. 設計liposome內外之離子梯度 21 5. 以螢光光度計量測以及測量結果的判讀 21 第三章 結果 22 一、 全長之CpaA表現載體之構築 22 二、 分析全長之CpaA之表現條件篩選 23 三、 分析以FSEC篩選適合目標蛋白之detergent 24 四、 蛋白質純化之結果 25 五、 全長之CpaA proteoliposome螢光光譜之結果分析 26 第四章 討論 29 一、 優化蛋白表現以及detergent篩選效率 29 二、 CpaA proteoliposome實驗驗證 29 三、 分別對CpaA-N端與C端以及全長進行生物資訊分析 30 四、 與同源蛋白質的結構分析 32 五、 結晶條件的檢討 33 六、 Future work : 對重要胺基酸進行突變 34 七、 總結 34 參考文獻 36 附錄一、Antoinduction medium 配方 64 附錄二、GFP count定量標準曲線 65 附錄三、BCA assays標準曲線 66 附錄四、本研究所用表現載體示意圖 6