Molecular pathogenesis of Xanthomonas secondary messenger c-di-GMP and phytoplasma effector SAPX

c-di-GMP是一種廣泛存在於細菌中的二級傳訊分子，可以調控許多重要的細胞功能，如細胞型態的改變、菌體的移動和生物膜的形成。除此之外，c-di-GMP也參與致病因子的表達，影響病原菌的致病能力。c-di-GMP 的合成是由兩個GTP經diguanylate cyclases (DGCs)催化形成；而c-di-GMP的降解則是經由phosphodiesterases (PDEs)水解成 5'-phosphoguanylyl-(3'-5')-guanosine (pGpG)。目前在細菌中發現的DGCs和PDEs分別具有保守的GGDEF以及EAL蛋白結構區域，這些蛋白雖然為數眾多且廣泛分布在原核細菌中，但在動物以及植物中並沒有發現任何具有這兩種結構區域的蛋白。先前文獻證實哺乳動物細胞的DEAD-box polypeptide 41 (DDX41)能夠辨認並結合 c-di-GMP，活化STING-TBK1-IRF3的免疫訊息傳遞路徑，產生干擾素(Interferons)來抵抗病原菌。因此，專屬於微生物的c-di-GMP分子可成為宿主辨識外來病原菌的標靶分子，具有誘發宿主防禦系統的能力。本研究測試c-di-GMP誘發植物免疫反應之可能性探討。首先，透過BLAST之胺基酸序列比較分析，發現擬南芥(Arabidopsis)基因組中具有二個胺基酸序列相似度高達86 %的DDX41同源基因。因此本研究藉由E. coli的表現系統進行擬南芥DDX41同源蛋白的表現與純化，並利用pull-down實驗測試與 c-di-GMP結合的能力。同時，已知Xanthomonas campestris pv. campestris中的 XC02498004 (含GGDEF結構區域)和 XC14118004 (含EAL結構區域)對病原菌的致病性有相當程度的影響，因此本研究建構XC02498004和XC14118004的轉基因擬南芥，測試植物內表現c-di-GMP合成或降解的酵素對植物免疫反應的影響。目前結果尚未發現 c-di-GMP能誘發植物的免疫反應的證據。c-di-GMP is a secondary messenger in bacteria. It regulates a range of physiological functions including developmental transition, motility, biofilm formation, and virulence. c-di-GMP is produced from two molecules of GTP by diguanylate cyclases (DGCs) and is broken down into 5'-phosphguanylyl-(3'-5')-guanosine (pGpG) by phosphodiesterases (PDEs). DGC activity is associated with the GGDEF domain and PDE activity is associated with the EAL domain. Both GGDEF and EAL domains are only been found in Bacteria, but not in plants and animals. Previously, DEAD-box polypeptide 41 (DDX41) has been shown to play as a sensor that can bind c-di-GMP and trigger the production of type I interferon via STING-TBK1-IRF3 signaling pathway in mammalian cells. Therefore, c-di-GMP acts as a pathogen-associated molecular pattern and elicits a host immune response in mammalian cells. To determine whether c-di-GMP can trigger a plant immune response or not, we first purified recombinant AtDDX41L1, the DDX41 homolog in Arabidopsis, and examine the interaction between AtDDX41L1 and c-di-GMP. At the same time, we generated 35S::XC02498004 and 35S::XC14118004 transgenic lines, which contain the GGDEF and EAL domain respectively. These transgenic plants are able to examine the effects of c-di-GMP in the plant immune response. So far, our findings suggest that c-di-GMP is not able to trigger an immune response in plants.目錄 謝誌 i 摘要(一) ii Abstract (I) iii 目錄 iv 圖目錄 viii 附錄目錄 ix 第一部分 第一章 前言 1 一、植物之免疫系統 1 二、c-di-GMP之介紹 2 三、c-di-GMP與宿主免疫系統之關係 3 四、Xanthomonas 之介紹 4 五、研究目的與策略 4 1. 建立內生性 c-di-GMP 相關之轉基因植物 5 2. 植物中辨識 c-di-GMP 的蛋白之推測 5 第二章 材料與方法 6 ※材料 6 ※方法 6 一、載體之構築 6 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 6 2. DNA膠體電泳 6 3. PCR產物之純化 7 4. PCR產物和質體之限制?作用 7 5. PCR產物與質體之接合反應 7 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 7 7. 大腸桿菌之轉殖 8 8. 重組DNA之鑑定 8 二、擬南芥轉殖株之建立 9 1. 農桿菌勝任細胞之製備 9 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 9 3. 農桿菌轉殖基因至擬南芥 9 4. 擬南芥轉殖株之篩選 10 三、重組蛋白表現及純化 10 1. 大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 10 2. SDS-PAGE蛋白質電泳 11 3. 大腸桿菌重組蛋白質之大量表現 11 4. 蛋白質之純化 11 5. 蛋白質濃縮、透析及保存 12 四、抗體製備及純化 12 1. 抗體製備 12 2. 抗體純化 12 3. 西方墨點法(Western blotting ) 13 五、病原菌接種 13 六、蛋白質交互作用沉澱試驗 (pull-down assay) 14 第三章 結果 15 一、製備的多株抗體能夠檢測轉殖植物的蛋白表現量 15 二、35S::XC02498004與35S::XC14118004轉殖植物之抗病能力與野生型擬南芥無明顯差異 15 三、擬南芥AtDDX41重組蛋白無法與c-di-GMP結合 16 第四章 討論 18 第五章 參考文獻 20 第六章 圖、表 22 第七章 附錄 28 第二部分 摘要(二) 46 Abstract (II) 47 第一章 前言 48 一、植物菌質體 (Phytoplasma)之介紹 48 二、植物菌質體分群 49 翠菊黃萎病菌質體 49 Candidatus phytoplasma mali 50 三、植物菌質體之分泌系統 50 四、致病蛋白分子SAP11AYWB在擬南芥中的研究 51 五、植物、草食性昆蟲與昆蟲天敵的關係 53 六、揮發性物質Methoxypyrazines (MPs)之介紹 53 七、植物內IBMP生合成之相關研究 54 第二章 研究目的與策略 55 第三章 材料與方法 56 ※材料 56 ※方法 56 一、載體之構築 56 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 56 2. DNA膠體電泳 56 3. PCR產物之純化 57 4. PCR產物和質體之限制?作用 57 5. PCR產物與質體之接合反應 57 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 57 7. 大腸桿菌之轉殖 58 8. 重組DNA之鑑定 58 二、菸草短暫表現系統之農桿菌注射法(Agroinfiltration) 58 1. 農桿菌勝任細胞之製備 59 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 59 3. 針筒注射接種法(syringe infiltration) 59 三、大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 60 四、西方墨點法(Western blotting ) 60 五、固相微萃取法 (solid-phase microextration, SPME) 61 1. 轉殖菸草之氣味分析 61 2. 表現NbOMT之E. coli氣味分析 61 六、OMTs演化樹分析 62 七、圓葉菸草RNA之萃取 62 八、反轉錄?反應 (reverse transcription) 63 九、即時定量聚合?連鎖反應(real-time quantitative PCR) 63 十、石蠟切片及染色 63 1. 組織漸進脫水(dehydration) 63 2. 滲蠟(infiltration) 64 3. 包埋(embedding) 64 4. 修蠟(trimming) 64 5. 切片(sectioning) 64 6. 上片(mounting sections) 65 7. Safranin O-Fast green切片染色法 65 8. 封片 65 第四章 結果 66 一、 SAPXA和SAPXB改變菸草外表型並影響茉莉酸反應途徑的相關基因 66 二、35S::SAPXA與35S::SAPXB轉殖菸草缺乏揮發性IBMP分子 66 三、35S::SAPXA和35S::SAPXB轉殖菸草NbOMT1表現量低 67 四、菸草NbOMT1和NbOMT3之重組蛋白在大腸桿菌中表現會產生IBMP 68 五、SAPXA和SAPXB不會影響菸草木質素生合成 68 第五章 討論 69 第六章 參考文獻 71 第七章 圖、表 74 第八章 附錄 81 目錄 謝誌 i 摘要(一) ii Abstract (I) iii 目錄 iv 圖目錄 viii 附錄目錄 ix 第一部分 第一章 前言 1 一、植物之免疫系統 1 二、c-di-GMP之介紹 2 三、c-di-GMP與宿主免疫系統之關係 3 四、Xanthomonas 之介紹 4 五、研究目的與策略 4 1. 建立內生性 c-di-GMP 相關之轉基因植物 5 2. 植物中辨識 c-di-GMP 的蛋白之推測 5 第二章 材料與方法 6 ※材料 6 ※方法 6 一、載體之構築 6 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 6 2. DNA膠體電泳 6 3. PCR產物之純化 7 4. PCR產物和質體之限制?作用 7 5. PCR產物與質體之接合反應 7 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 7 7. 大腸桿菌之轉殖 8 8. 重組DNA之鑑定 8 二、擬南芥轉殖株之建立 9 1. 農桿菌勝任細胞之製備 9 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 9 3. 農桿菌轉殖基因至擬南芥 9 4. 擬南芥轉殖株之篩選 10 三、重組蛋白表現及純化 10 1. 大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 10 2. SDS-PAGE蛋白質電泳 11 3. 大腸桿菌重組蛋白質之大量表現 11 4. 蛋白質之純化 11 5. 蛋白質濃縮、透析及保存 12 四、抗體製備及純化 12 1. 抗體製備 12 2. 抗體純化 12 3. 西方墨點法(Western blotting ) 13 五、病原菌接種 13 六、蛋白質交互作用沉澱試驗 (pull-down assay) 14 第三章 結果 15 一、製備的多株抗體能夠檢測轉殖植物的蛋白表現量 15 二、35S::XC02498004與35S::XC14118004轉殖植物之抗病能力與野生型擬南芥無明顯差異 15 三、擬南芥AtDDX41重組蛋白無法與c-di-GMP結合 16 第四章 討論 18 第五章 參考文獻 20 第六章 圖、表 22 第七章 附錄 28 第二部分 摘要(二) 46 Abstract (II) 47 第一章 前言 48 一、植物菌質體 (Phytoplasma)之介紹 48 二、植物菌質體分群 49 翠菊黃萎病菌質體 49 Candidatus phytoplasma mali 50 三、植物菌質體之分泌系統 50 四、致病蛋白分子SAP11AYWB在擬南芥中的研究 51 五、植物、草食性昆蟲與昆蟲天敵的關係 53 六、揮發性物質Methoxypyrazines (MPs)之介紹 53 七、植物內IBMP生合成之相關研究 54 第二章 研究目的與策略 55 第三章 材料與方法 56 ※材料 56 ※方法 56 一、載體之構築 56 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 56 2. DNA膠體電泳 56 3. PCR產物之純化 57 4. PCR產物和質體之限制?作用 57 5. PCR產物與質體之接合反應 57 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 57 7. 大腸桿菌之轉殖 58 8. 重組DNA之鑑定 58 二、菸草短暫表現系統之農桿菌注射法(Agroinfiltration) 58 1. 農桿菌勝任細胞之製備 59 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 59 3. 針筒注射接種法(syringe infiltration) 59 三、大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 60 四、西方墨點法(Western blotting ) 60 五、固相微萃取法 (solid-phase microextration, SPME) 61 1. 轉殖菸草之氣味分析 61 2. 表現NbOMT之E. coli氣味分析 61 六、OMTs演化樹分析 62 七、圓葉菸草RNA之萃取 62 八、反轉錄?反應 (reverse transcription) 63 九、即時定量聚合?連鎖反應(real-time quantitative PCR) 63 十、石蠟切片及染色 63 1. 組織漸進脫水(dehydration) 63 2. 滲蠟(infiltration) 64 3. 包埋(embedding) 64 4. 修蠟(trimming) 64 5. 切片(sectioning) 64 6. 上片(mounting sections) 65 7. Safranin O-Fast green切片染色法 65 8. 封片 65 第四章 結果 66 一、 SAPXA和SAPXB改變菸草外表型並影響茉莉酸反應途徑的相關基因 66 二、35S::SAPXA與35S::SAPXB轉殖菸草缺乏揮發性IBMP分子 66 三、35S::SAPXA和35S::SAPXB轉殖菸草NbOMT1表現量低 67 四、菸草NbOMT1和NbOMT3之重組蛋白在大腸桿菌中表現會產生IBMP 68 五、SAPXA和SAPXB不會影響菸草木質素生合成 68 第五章 討論 69 第六章 參考文獻 71 第七章 圖、表 74 第八章 附錄 81 目錄 謝誌 i 摘要(一) ii Abstract (I) iii 目錄 iv 圖目錄 viii 附錄目錄 ix 第一部分 第一章 前言 1 一、植物之免疫系統 1 二、c-di-GMP之介紹 2 三、c-di-GMP與宿主免疫系統之關係 3 四、Xanthomonas 之介紹 4 五、研究目的與策略 4 1. 建立內生性 c-di-GMP 相關之轉基因植物 5 2. 植物中辨識 c-di-GMP 的蛋白之推測 5 第二章 材料與方法 6 ※材料 6 ※方法 6 一、載體之構築 6 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 6 2. DNA膠體電泳 6 3. PCR產物之純化 7 4. PCR產物和質體之限制?作用 7 5. PCR產物與質體之接合反應 7 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 7 7. 大腸桿菌之轉殖 8 8. 重組DNA之鑑定 8 二、擬南芥轉殖株之建立 9 1. 農桿菌勝任細胞之製備 9 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 9 3. 農桿菌轉殖基因至擬南芥 9 4. 擬南芥轉殖株之篩選 10 三、重組蛋白表現及純化 10 1. 大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 10 2. SDS-PAGE蛋白質電泳 11 3. 大腸桿菌重組蛋白質之大量表現 11 4. 蛋白質之純化 11 5. 蛋白質濃縮、透析及保存 12 四、抗體製備及純化 12 1. 抗體製備 12 2. 抗體純化 12 3. 西方墨點法(Western blotting ) 13 五、病原菌接種 13 六、蛋白質交互作用沉澱試驗 (pull-down assay) 14 第三章 結果 15 一、製備的多株抗體能夠檢測轉殖植物的蛋白表現量 15 二、35S::XC02498004與35S::XC14118004轉殖植物之抗病能力與野生型擬南芥無明顯差異 15 三、擬南芥AtDDX41重組蛋白無法與c-di-GMP結合 16 第四章 討論 18 第五章 參考文獻 20 第六章 圖、表 22 第七章 附錄 28 第二部分 摘要(二) 46 Abstract (II) 47 第一章 前言 48 一、植物菌質體 (Phytoplasma)之介紹 48 二、植物菌質體分群 49 翠菊黃萎病菌質體 49 Candidatus phytoplasma mali 50 三、植物菌質體之分泌系統 50 四、致病蛋白分子SAP11AYWB在擬南芥中的研究 51 五、植物、草食性昆蟲與昆蟲天敵的關係 53 六、揮發性物質Methoxypyrazines (MPs)之介紹 53 七、植物內IBMP生合成之相關研究 54 第二章 研究目的與策略 55 第三章 材料與方法 56 ※材料 56 ※方法 56 一、載體之構築 56 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 56 2. DNA膠體電泳 56 3. PCR產物之純化 57 4. PCR產物和質體之限制?作用 57 5. PCR產物與質體之接合反應 57 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 57 7. 大腸桿菌之轉殖 58 8. 重組DNA之鑑定 58 二、菸草短暫表現系統之農桿菌注射法(Agroinfiltration) 58 1. 農桿菌勝任細胞之製備 59 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 59 3. 針筒注射接種法(syringe infiltration) 59 三、大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 60 四、西方墨點法(Western blotting ) 60 五、固相微萃取法 (solid-phase microextration, SPME) 61 1. 轉殖菸草之氣味分析 61 2. 表現NbOMT之E. coli氣味分析 61 六、OMTs演化樹分析 62 七、圓葉菸草RNA之萃取 62 八、反轉錄?反應 (reverse transcription) 63 九、即時定量聚合?連鎖反應(real-time quantitative PCR) 63 十、石蠟切片及染色 63 1. 組織漸進脫水(dehydration) 63 2. 滲蠟(infiltration) 64 3. 包埋(embedding) 64 4. 修蠟(trimming) 64 5. 切片(sectioning) 64 6. 上片(mounting sections) 65 7. Safranin O-Fast green切片染色法 65 8. 封片 65 第四章 結果 66 一、 SAPXA和SAPXB改變菸草外表型並影響茉莉酸反應途徑的相關基因 66 二、35S::SAPXA與35S::SAPXB轉殖菸草缺乏揮發性IBMP分子 66 三、35S::SAPXA和35S::SAPXB轉殖菸草NbOMT1表現量低 67 四、菸草NbOMT1和NbOMT3之重組蛋白在大腸桿菌中表現會產生IBMP 68 五、SAPXA和SAPXB不會影響菸草木質素生合成 68 第五章 討論 69 第六章 參考文獻 71 第七章 圖、表 74 第八章 附錄 81 目錄 謝誌 i 摘要(一) ii Abstract (I) iii 目錄 iv 圖目錄 viii 附錄目錄 ix 第一部分 第一章 前言 1 一、植物之免疫系統 1 二、c-di-GMP之介紹 2 三、c-di-GMP與宿主免疫系統之關係 3 四、Xanthomonas 之介紹 4 五、研究目的與策略 4 1. 建立內生性 c-di-GMP 相關之轉基因植物 5 2. 植物中辨識 c-di-GMP 的蛋白之推測 5 第二章 材料與方法 6 ※材料 6 ※方法 6 一、載體之構築 6 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 6 2. DNA膠體電泳 6 3. PCR產物之純化 7 4. PCR產物和質體之限制?作用 7 5. PCR產物與質體之接合反應 7 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 7 7. 大腸桿菌之轉殖 8 8. 重組DNA之鑑定 8 二、擬南芥轉殖株之建立 9 1. 農桿菌勝任細胞之製備 9 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 9 3. 農桿菌轉殖基因至擬南芥 9 4. 擬南芥轉殖株之篩選 10 三、重組蛋白表現及純化 10 1. 大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 10 2. SDS-PAGE蛋白質電泳 11 3. 大腸桿菌重組蛋白質之大量表現 11 4. 蛋白質之純化 11 5. 蛋白質濃縮、透析及保存 12 四、抗體製備及純化 12 1. 抗體製備 12 2. 抗體純化 12 3. 西方墨點法(Western blotting ) 13 五、病原菌接種 13 六、蛋白質交互作用沉澱試驗 (pull-down assay) 14 第三章 結果 15 一、製備的多株抗體能夠檢測轉殖植物的蛋白表現量 15 二、35S::XC02498004與35S::XC14118004轉殖植物之抗病能力與野生型擬南芥無明顯差異 15 三、擬南芥AtDDX41重組蛋白無法與c-di-GMP結合 16 第四章 討論 18 第五章 參考文獻 20 第六章 圖、表 22 第七章 附錄 28 第二部分 摘要(二) 46 Abstract (II) 47 第一章 前言 48 一、植物菌質體 (Phytoplasma)之介紹 48 二、植物菌質體分群 49 翠菊黃萎病菌質體 49 Candidatus phytoplasma mali 50 三、植物菌質體之分泌系統 50 四、致病蛋白分子SAP11AYWB在擬南芥中的研究 51 五、植物、草食性昆蟲與昆蟲天敵的關係 53 六、揮發性物質Methoxypyrazines (MPs)之介紹 53 七、植物內IBMP生合成之相關研究 54 第二章 研究目的與策略 55 第三章 材料與方法 56 ※材料 56 ※方法 56 一、載體之構築 56 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 56 2. DNA膠體電泳 56 3. PCR產物之純化 57 4. PCR產物和質體之限制?作用 57 5. PCR產物與質體之接合反應 57 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 57 7. 大腸桿菌之轉殖 58 8. 重組DNA之鑑定 58 二、菸草短暫表現系統之農桿菌注射法(Agroinfiltration) 58 1. 農桿菌勝任細胞之製備 59 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 59 3. 針筒注射接種法(syringe infiltration) 59 三、大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 60 四、西方墨點法(Western blotting ) 60 五、固相微萃取法 (solid-phase microextration, SPME) 61 1. 轉殖菸草之氣味分析 61 2. 表現NbOMT之E. coli氣味分析 61 六、OMTs演化樹分析 62 七、圓葉菸草RNA之萃取 62 八、反轉錄?反應 (reverse transcription) 63 九、即時定量聚合?連鎖反應(real-time quantitative PCR) 63 十、石蠟切片及染色 63 1. 組織漸進脫水(dehydration) 63 2. 滲蠟(infiltration) 64 3. 包埋(embedding) 64 4. 修蠟(trimming) 64 5. 切片(sectioning) 64 6. 上片(mounting sections) 65 7. Safranin O-Fast green切片染色法 65 8. 封片 65 第四章 結果 66 一、 SAPXA和SAPXB改變菸草外表型並影響茉莉酸反應途徑的相關基因 66 二、35S::SAPXA與35S::SAPXB轉殖菸草缺乏揮發性IBMP分子 66 三、35S::SAPXA和35S::SAPXB轉殖菸草NbOMT1表現量低 67 四、菸草NbOMT1和NbOMT3之重組蛋白在大腸桿菌中表現會產生IBMP 68 五、SAPXA和SAPXB不會影響菸草木質素生合成 68 第五章 討論 69 第六章 參考文獻 71 第七章 圖、表 74 第八章 附錄 81 目錄 謝誌 i 摘要(一) ii Abstract (I) iii 目錄 iv 圖目錄 viii 附錄目錄 ix 第一部分 第一章 前言 1 一、植物之免疫系統 1 二、c-di-GMP之介紹 2 三、c-di-GMP與宿主免疫系統之關係 3 四、Xanthomonas 之介紹 4 五、研究目的與策略 4 1. 建立內生性 c-di-GMP 相關之轉基因植物 5 2. 植物中辨識 c-di-GMP 的蛋白之推測 5 第二章 材料與方法 6 ※材料 6 ※方法 6 一、載體之構築 6 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 6 2. DNA膠體電泳 6 3. PCR產物之純化 7 4. PCR產物和質體之限制?作用 7 5. PCR產物與質體之接合反應 7 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 7 7. 大腸桿菌之轉殖 8 8. 重組DNA之鑑定 8 二、擬南芥轉殖株之建立 9 1. 農桿菌勝任細胞之製備 9 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 9 3. 農桿菌轉殖基因至擬南芥 9 4. 擬南芥轉殖株之篩選 10 三、重組蛋白表現及純化 10 1. 大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 10 2. SDS-PAGE蛋白質電泳 11 3. 大腸桿菌重組蛋白質之大量表現 11 4. 蛋白質之純化 11 5. 蛋白質濃縮、透析及保存 12 四、抗體製備及純化 12 1. 抗體製備 12 2. 抗體純化 12 3. 西方墨點法(Western blotting ) 13 五、病原菌接種 13 六、蛋白質交互作用沉澱試驗 (pull-down assay) 14 第三章 結果 15 一、製備的多株抗體能夠檢測轉殖植物的蛋白表現量 15 二、35S::XC02498004與35S::XC14118004轉殖植物之抗病能力與野生型擬南芥無明顯差異 15 三、擬南芥AtDDX41重組蛋白無法與c-di-GMP結合 16 第四章 討論 18 第五章 參考文獻 20 第六章 圖、表 22 第七章 附錄 28 第二部分 摘要(二) 46 Abstract (II) 47 第一章 前言 48 一、植物菌質體 (Phytoplasma)之介紹 48 二、植物菌質體分群 49 翠菊黃萎病菌質體 49 Candidatus phytoplasma mali 50 三、植物菌質體之分泌系統 50 四、致病蛋白分子SAP11AYWB在擬南芥中的研究 51 五、植物、草食性昆蟲與昆蟲天敵的關係 53 六、揮發性物質Methoxypyrazines (MPs)之介紹 53 七、植物內IBMP生合成之相關研究 54 第二章 研究目的與策略 55 第三章 材料與方法 56 ※材料 56 ※方法 56 一、載體之構築 56 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 56 2. DNA膠體電泳 56 3. PCR產物之純化 57 4. PCR產物和質體之限制?作用 57 5. PCR產物與質體之接合反應 57 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 57 7. 大腸桿菌之轉殖 58 8. 重組DNA之鑑定 58 二、菸草短暫表現系統之農桿菌注射法(Agroinfiltration) 58 1. 農桿菌勝任細胞之製備 59 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 59 3. 針筒注射接種法(syringe infiltration) 59 三、大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 60 四、西方墨點法(Western blotting ) 60 五、固相微萃取法 (solid-phase microextration, SPME) 61 1. 轉殖菸草之氣味分析 61 2. 表現NbOMT之E. coli氣味分析 61 六、OMTs演化樹分析 62 七、圓葉菸草RNA之萃取 62 八、反轉錄?反應 (reverse transcription) 63 九、即時定量聚合?連鎖反應(real-time quantitative PCR) 63 十、石蠟切片及染色 63 1. 組織漸進脫水(dehydration) 63 2. 滲蠟(infiltration) 64 3. 包埋(embedding) 64 4. 修蠟(trimming) 64 5. 切片(sectioning) 64 6. 上片(mounting sections) 65 7. Safranin O-Fast green切片染色法 65 8. 封片 65 第四章 結果 66 一、 SAPXA和SAPXB改變菸草外表型並影響茉莉酸反應途徑的相關基因 66 二、35S::SAPXA與35S::SAPXB轉殖菸草缺乏揮發性IBMP分子 66 三、35S::SAPXA和35S::SAPXB轉殖菸草NbOMT1表現量低 67 四、菸草NbOMT1和NbOMT3之重組蛋白在大腸桿菌中表現會產生IBMP 68 五、SAPXA和SAPXB不會影響菸草木質素生合成 68 第五章 討論 69 第六章 參考文獻 71 第七章 圖、表 74 第八章 附錄 81 目錄 謝誌 i 摘要(一) ii Abstract (I) iii 目錄 iv 圖目錄 viii 附錄目錄 ix 第一部分 第一章 前言 1 一、植物之免疫系統 1 二、c-di-GMP之介紹 2 三、c-di-GMP與宿主免疫系統之關係 3 四、Xanthomonas 之介紹 4 五、研究目的與策略 4 1. 建立內生性 c-di-GMP 相關之轉基因植物 5 2. 植物中辨識 c-di-GMP 的蛋白之推測 5 第二章 材料與方法 6 ※材料 6 ※方法 6 一、載體之構築 6 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 6 2. DNA膠體電泳 6 3. PCR產物之純化 7 4. PCR產物和質體之限制?作用 7 5. PCR產物與質體之接合反應 7 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 7 7. 大腸桿菌之轉殖 8 8. 重組DNA之鑑定 8 二、擬南芥轉殖株之建立 9 1. 農桿菌勝任細胞之製備 9 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 9 3. 農桿菌轉殖基因至擬南芥 9 4. 擬南芥轉殖株之篩選 10 三、重組蛋白表現及純化 10 1. 大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 10 2. SDS-PAGE蛋白質電泳 11 3. 大腸桿菌重組蛋白質之大量表現 11 4. 蛋白質之純化 11 5. 蛋白質濃縮、透析及保存 12 四、抗體製備及純化 12 1. 抗體製備 12 2. 抗體純化 12 3. 西方墨點法(Western blotting ) 13 五、病原菌接種 13 六、蛋白質交互作用沉澱試驗 (pull-down assay) 14 第三章 結果 15 一、製備的多株抗體能夠檢測轉殖植物的蛋白表現量 15 二、35S::XC02498004與35S::XC14118004轉殖植物之抗病能力與野生型擬南芥無明顯差異 15 三、擬南芥AtDDX41重組蛋白無法與c-di-GMP結合 16 第四章 討論 18 第五章 參考文獻 20 第六章 圖、表 22 第七章 附錄 28 第二部分 摘要(二) 46 Abstract (II) 47 第一章 前言 48 一、植物菌質體 (Phytoplasma)之介紹 48 二、植物菌質體分群 49 翠菊黃萎病菌質體 49 Candidatus phytoplasma mali 50 三、植物菌質體之分泌系統 50 四、致病蛋白分子SAP11AYWB在擬南芥中的研究 51 五、植物、草食性昆蟲與昆蟲天敵的關係 53 六、揮發性物質Methoxypyrazines (MPs)之介紹 53 七、植物內IBMP生合成之相關研究 54 第二章 研究目的與策略 55 第三章 材料與方法 56 ※材料 56 ※方法 56 一、載體之構築 56 1. 聚合?連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 56 2. DNA膠體電泳 56 3. PCR產物之純化 57 4. PCR產物和質體之限制?作用 57 5. PCR產物與質體之接合反應 57 6. 大腸桿菌勝任細胞之製備 57 7. 大腸桿菌之轉殖 58 8. 重組DNA之鑑定 58 二、菸草短暫表現系統之農桿菌注射法(Agroinfiltration) 58 1. 農桿菌勝任細胞之製備 59 2. 農桿菌之轉殖及鑑定 59 3. 針筒注射接種法(syringe infiltration) 59 三、大腸桿菌重組蛋白質之小量表現 60 四、西方墨點法(Western blotting ) 60 五、固相微萃取法 (solid-phase microextration, SPME) 61 1. 轉殖菸草之氣味分析 61 2. 表現NbOMT之E. coli氣味分析 61 六、OMTs演化樹分析 62 七、圓葉菸草RNA之萃取 62 八、反轉錄?反應 (reverse transcription) 63 九、即時定量聚合?連鎖反應(real-time quantitative PCR) 63 十、石蠟切片及染色 63 1. 組織漸進脫水(dehydration) 63 2. 滲蠟(infiltration) 64 3. 包埋(embedding) 64 4. 修蠟(trimming) 64 5. 切片(sectioning) 64 6. 上片(mounting sections) 65 7. Safranin O-Fast green切片染色法 65 8. 封片 65 第四章 結果 66 一、 SAPXA和SAPXB改變菸草外表型並影響茉莉酸反應途徑的相關基因 66 二、35S::SAPXA與35S::SAPXB轉殖菸草缺乏揮發性IBMP分子 66 三、35S::SAPXA和35S::SAPXB轉殖菸草NbOMT1表現量低 67 四、菸草NbOMT1和NbOMT3之重組蛋白在大腸桿菌中表現會產生IBMP 68 五、SAPXA和SAPXB不會影響菸草木質素生合成 68 第五章 討論 69 第六章 參考文獻 71 第七章 圖、表 74 第八章 附錄 8