Studies on antioxidant ability of the oligopeptides derived from metallothionein

MT (metallothioneins) are widely found in organisms and are highly conserved on their amino acid sequences. The protein sequence consists of more cysteine residues than other kinds of proteins. (MT sequences have 61 to 74 amino acids, and which contain 9 to 31 cysteine) So it can utilize the thiol group of cysteine to bind heavy metals (ex.: Zn, Cd and Cu) and to decrease the cytotoxic effects. Moreover, when cells are exposed to the environment having either ultraviolet rays or H2O2 will lead to induce the generation of reactive oxygen species (ROS). From the previous studies, it has been found that MT has the ability to scavenge free radicals. Therefore, we hope to improve cell survival by adding MT protein under stress. It has been suggested that the consensus region of MT in different species will be little different, and these changes may be related with the antioxidative ability of MT in different species, so we synthesize different oligopeptides derived from MT. We establish a test platform via skin cells to study the different antioxidative ability of synthetic peptides derived from MT on cells, and test their antioxidative ability by in vitro and in vivo ways. In the in vitro part, it can be found that peptide1728 (CRKSCC), 1730 (CKKSCC), and 1732 (SCKKSCC) have significant effect to scavenge free radical in 40 μM by ABTS assay. In the in vivo part, using ROS assay through H2O2 to induce ROS in HaCaT cell, we found that 100 μM of peptide1732 can offer resistance under oxidative stress. After inducing ROS, peptide1728, 1729 (SCCDCC), and 1730 can reduce the impact of cell. Moreover, we used UV to induce ROS, and found that 10 μM peptide1728 can protect cell against UV. Using 10 μM peptide1728, 1732, and 50 μM peptide1729 can reduce the impact of cell. It has been revealed in past studies that speculated SCKKSCC is the combined section of MT and megalin. First, we found that there is megalin expression in HaCaT cell, then adding peptide1732 (SCKKSCC) to cell, and found peptide1732 can express in HaCaT cell by fluorescence microscopy. Second, the past studies showed that RA can promote megalin expression. As RA is added, peptide1732 increase in HaCaT cell. Additionally, peptide1732 and megalin increase slightly after 30 minutes by confocal microscopy. Finally, we wonder to kow whether the patients who has Melanoma can use the peptides or not. So we used human skin cancer cell line (A2058) to have a test. We found that peptides could raise cell viability and mobility. That represents the peptides could promote A2058 growth, hence they should not be used by patients who has Melanoma.MT（metallothionein），是一種廣泛存在於生物體中具有高度保留性的金屬硫蛋白，此蛋白是由較多的cysteine所組成（在MT序列全長61至74個胺基酸中就含有9至31個cysteine），因此可利用cysteine的硫醇基和重金屬結合（例如：鋅、鎘、銅），進而降低因重金屬在細胞內累積所產生的細胞毒性。另外，研究指出當細胞存在紫外線或H2O2等毒性物質存在的環境下，會導致活性氧化物質（reactive oxygen species, ROS）的產生，由過去的研究中發現MT亦具有清除自由基的能力，因此希望藉由添加MT蛋白來提升細胞在逆境下的存活率。本研究發現不同物種之MT序列其consensus region的胺基酸組成會有些許差異，進而推測這些改變可能與不同物種間MT蛋白抗氧化能力強弱有關，故針對此部分合成出具有差異性的短胜肽（oligopeptide）。 本研究建立一套皮膚細胞的測試平台，進行MT人工合成短胜肽對於細胞抗氧化能力差異之研究，並利用in vitro及細胞試驗測試這些短胜肽是否具有不同清除自由基的能力。在in vitro的部分，透過ABTS assay發現其中peptide1728（CRKSCC）、1730（CKKSCC）、1732（SCKKSCC）在濃度40 μM時，具有顯著的清除自由基能力；而在細胞試驗的部分，利用ROS assay模擬先後擦在皮膚上（HaCaT細胞株）的情況，結果發現100 μM peptide1732較能夠預防細胞抵禦氧化壓力的侵害，效果較相同濃度之抗氧化劑好，而100 μM peptide1728、1729（SCCDCC）、1730則是在細胞遭受氧化壓力損傷後，具有修復細胞的功能。接著我們利用UV模擬防曬的機制，結果顯示事先塗抹10 μM peptide1728較能抵禦UV光的照射，若需要事後修復紫外線造成的損傷，則塗抹10 μM 1728、1732以及50 μM 1729較有修復皮膚細胞的效果。 在2004年出現了一篇研究指出MT藉由與近曲小管上的megalin結合進入細胞，並推測SCKKSCC即為MT與megalin結合的區域。因此本篇論文為了更進一步探討peptide1732進入細胞的表現。首先，我們先確定了HaCaT細胞株有megalin的表現，並且將較具預防效果的peptide1732-biotin加入細胞，以螢光顯微鏡觀察，結果發現在HaCaT細胞株內有peptide1732的表現。另外，文獻指出RA會促進megalin的表現，於是藉由螢光顯微鏡觀察，結果顯示隨著RA（retinoic acid）的加入，peptide1732進入細胞的量會增加。接著為了得到細胞或組織內部微細結構的螢光影像，於是利用共軛焦顯微鏡觀察，結果發現peptide1732處理30分鐘後，peptide進入的量以及megalin的量有些微增加。 最後，我們想了解本研究peptide是否能抑制或促進癌症生長，以研判病患能否使用這些peptide。於是以相同為皮膚細胞株的人類黑色素瘤細胞株（A2058）做測試，觀察了peptide對於A2058細胞存活率以及轉移的影響，將peptide加此細胞株，結果發現peptide會影響黑色素瘤細胞株之存活率以及移動性，表示本研究peptide會促使此癌症細胞生長，推測並不適合患有黑色素癌患者使用。誌謝辭 i 摘要 ii Abstract iii 目錄 iv 第一章前言 1 第一節研究動機 1 第二節研究策略 1 實驗架構圖 2 第二章文獻回顧 3 第一節自由基 3 一、自由基在生物體內的生理作用 3 二、ROS的生成途徑 4 三、過多自由基造成的傷害 4 四、抗氧化與自由基 5 五、具有抗氧化及抗老化能力之胜肽 6 第二節金屬硫蛋白（metallothionein, MT） 7 一、金屬硫蛋白簡介 7 二、金屬硫蛋白的分類 7 三、MT的生理功能 9 四、金屬硫蛋白質合成 9 五、MT與皮膚的關係 10 六、MT的receptor──megalin 10 第三節HaCaT cell 10 第四節皮膚癌 11 第三章研究材料與方法 12 一、HaCaT細胞培養 12 二、細胞冷凍保存與解凍 12 三、短胜肽（oligopeptide）的溶解方法 12 四、MTS assay測試peptide的細胞毒性 13 五、核酸洋菜膠體電泳（agarose gel electrophoresis）的分析與記錄 13 六、細胞總量RNA萃取 ( Total RNA extraction) 14 七、反轉錄聚合連鎖反應 (Reverse transcription PCR) 14 八、即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應 (Real-time RT-PCR) 14 九、細胞總量蛋白萃取 ( Total protein extraction) 15 十、蛋白濃度分析 (Protein quantification) 15 十一、西方墨點法 (Western blot) 15 十二、自由基的清除能力分析 18 十三、免疫螢光染色鑑定 19 十四、Wound healing assay 19 十五、藥品 19 十六、試劑配方 20 十七、其餘藥品列表及縮寫 22 第四章結果 23 一、短胜肽（short oligopeptide）的設計 23 （一）沒有經過修改的，共同的MT consensus region： 23 （二）人工合成的其他對照組： 23 二、確定HaCaT cell有megalin之表現 23 三、siRNA 24 四、MTS assay測試oligopeptide劑量以及抗氧化劑與HaCaT細胞株之存活率 24 五、ABTS assay測試 oligopeptide與抗氧化劑之清除自由基能力 24 六、ROS assay測試不同oligopeptide與抗氧化劑對於H2O2誘導皮膚細胞中的ROS含量的影響 25 七、ROS assay測試不同oligopeptide對於UV誘導皮膚細胞中的ROS含量的影響 26 八、peptide螢光位置確認 27 （一）Retinoic acid處理人類皮膚細胞促進megalin 蛋白表現量 27 （二）Retinoic acid處理人類皮膚細胞促進megalin mRNA的轉錄調控 27 （三）免疫螢光染色 27 九、oligopeptide與黑色素瘤細胞株之關係 28 （一）MTS assay測試oligopeptide劑量與黑色素瘤細胞株之存活率 28 （二）利用Wound healing assay測試oligopeptide是否會影響黑色素瘤細胞株之細胞遷移 28 第五章討論 30 （一）藥物方面 30 （二）化妝品方面 30 參考文獻 34 圖表目錄 3