Effect of extract from pulsed light irradiated Grifola frondosa on 3T3-L1 preadipocytes

Obesity has become a global epidemic and an important health problem in recent years. It is also a risk factor of many chronic diseases. Maitake (Grifola frondosa) is a popular study material with good therapeutic effect and contains various bioactive substances and nutrients. Many studies have shown that Maitake mushroom exhibits anti-cancer activity, and it can improve ascites from cirrhosis, diabetes, hypertension, high cholesterol, etc. Moreover, the studies related to maitake are mainly focusing on physiological activities of polysaccharide and submerged culture condition of obtaining mycelium recently. In this study, Maitake fruiting body powders irradiated by pulsed light were extracted by 70% ethanol. There are four kinds of extracts from Maitake fruiting body powders irradiated by pulsed light, including aqueous layer (NW: non-irradiated; IW: irradiated) and ethyl acetate layer (NEA: non-irradiated; IEA: irradiated). We investigated the impact of NW and IW on cell cycle related protein expression and the anti-lipogenesis effect of extracts from Grifola frondosa on 3T3-L1 preadipocytes before and during differentiation. The results showed that the suppressive effect of NW, IW, NEA and IEA (at concentration 0~2.00 mg/mL) on cell viability of 3T3-L1 preadipocyte was dose- and time-dependent. In addition, that NW and IW could arrest cell cycle at G2 / M phase significantly in cell cycle analysis. After 3T3-L1 preadipocyte reached confluent, we added fresh medium with different extracts to incubate for 8 days. We found that all extracts could significantly reduce the formation of intracellular oil droplets, and NW and IW inhibited oil droplets formation to 81.45% and 81.55%, respectively. According to the results of western blotting, NW and IW significantly inhibited the expression of Cdc25C, which further regulate the protein expression of Cdc2 and p-Cdc2 (Thr161). Besides, p53 protein significantly activated by extracts, which revealed that 3T3-L1 preadipocyte would proceed to apoptosis after the inhibition of cell proliferation. In conclusion, we demonstrated that aqueous layer extracts (NW and IW) had the effect of anti-proliferation and the inhibition of oil droplets formation on 3T3-L1 preadipocyte. The mechanism of anti-proliferation of Maitake may be mainly regulated by inhibition of Cdc25C expression and activation of p53 protein. The high contains higher contents of total phenolic substances in the aqueous layer extracts may be associated with the effect of cell anti-proliferation in Maitake.近年來，肥胖已經成為全球重要之公共健康問題，同時也是許多慢性病的危險因子。而舞菇為國際上研究之熱門材料，其具有良好的健康食療效果，也含有多種的生理活性物質與營養。有研究指出舞菇具有抗癌功能，對於肝硬化腹水、糖尿病、高血壓、高血脂等亦有改善效果。現有研究多以舞菇多醣與其生理活性、菌絲體培養條件探討等作為研究題材。在本實驗中，利用舞菇子實體粉末經脈衝光照射前後，以 70% 乙醇萃取再以乙酸乙酯進行液液萃取，可區分得水層 (NW：未經脈衝光照射、IW：經脈衝光照射) 與乙酸乙酯層萃取物 (NEA：未經脈衝光照射、IEA：經脈衝光照射)，並探討萃取物對分化中之是否具抑制脂質生成之作用，以及對分化前之 3T3-L1 細胞株細胞週期相關蛋白之影響。 MTT 結果顯示，隨著濃度及作用時間增加，NW 與 IW (濃度0~1.00 mg/mL)、NEA 與 IEA (濃度0~2.00 mg/mL) 具有顯著抑制 3T3-L1 前驅脂肪細胞之增生，而存活率在 80% 以上不具有毒性。接著分析前驅脂肪細胞的生長週期，發現水層萃取物會使細胞生長週期停滯於 G2/M 期，並且有顯著差異。而培養前驅脂肪細胞約全滿後，加入萃取物於培養基中培養第 8 天後，發現 NW、IW、NEA及 IEA 可顯著降低細胞內油滴生成，以 NW 與 IW 效果最佳，可抑制油滴至 81.45% 與 81.55%。以 western blot 分析細胞週期相關蛋白之表現量得知，水層萃取物皆可抑制 Cdc25C 蛋白表現，進而影響 Cdc2 與 p-Cdc2 (Thr161) 蛋白之表現量，此結果可能與細胞停滯於 G2/M 期有關。此外， p53 蛋白也受到萃取物活化，代表細胞之增生受抑制後，可能會走向細胞凋亡的路徑。 綜合上述實驗結果，本研究發現水層萃取物 NW 與 IW 對於分化前 3T3-L1 前驅脂肪細胞具有抑制增生之效果，對分化中的細胞油滴生成抑制效果也較明顯。而抑制細胞增生之效果可能與萃取物調控細胞週期相關蛋白 Cdc25C 與 p53 有關。而水層中含有較高的總酚類物質，可能與抑制前驅脂肪細胞增生效果有關。表次 viii 圖次 ix 前言 1 文獻整理 3 一 、舞菇 3 (一) 簡介 3 (二) 藥理活性 3 二 、脈衝光照射 5 (一) 脈衝光應用 5 (二) 照射與維生素D 5 三 、肥胖 7 (一) 肥胖的定義與成因 7 (二) 肥胖的風險與危害 9 四 、脂肪組織與脂肪細胞 9 (一) 脂肪組織 9 (二) 前驅脂肪細胞 10 (三) 3T3-L1前驅脂肪細胞與分化相關機制 10 五 、細胞週期與其調控因子 14 (一) Cyclins與CDKs (cyclin-dependent kinases) 17 (二) 調控蛋白與因子 19 六 、天然化合物對於脂肪細胞之研究 19 研究動機 21 實驗架構 22 材料與方法 23 一 、實驗材料 23 (一) 舞菇子實體樣品粉末 23 (二) 細胞株 23 (三) 試藥 23 二 實驗方法 25 (一) 樣品製備 25 (二) 生理活性物質分析 26 (三) 3T3-L1細胞株培養 28 (四) 3T3-L1前驅脂肪細胞存活率 28 (五) 細胞週期 (Cell cycle) 29 (六) 油紅染色 (Oil red O staining) 29 (七) 細胞週期相關蛋白測定 30 (八) 統計分析 31 結果與討論 32 一 、樣品萃取率與生理活性物質分析 32 (一) 樣品萃取率 32 (二) 萃取物中維生素 D2 之含量 35 (三) 總酚含量與酚類化合物組成 35 二 、3T3-L1脂肪細胞生長分化情形 40 三 、細胞存活率試驗 40 (一) 未照射舞菇 (NW) 與脈衝光照射舞菇 (IW) 70% 乙醇萃之水層對小鼠前驅脂肪細胞株 (3T3-L1 preadipocytes) 存活率之影響 42 (二) 未照射舞菇 (NEA) 與脈衝光照射舞菇 (IEA) 70% 乙醇萃之乙酸乙酯層對小鼠前驅脂肪細胞株 (3T3-L1 preadipocytes) 存活率之影響 42 四 、細胞週期分析 49 五 、油紅染色分析 56 六 、細胞週期相關蛋白表現量 62 (一) 未照射舞菇 (NW) 與脈衝光照射舞菇 (IW) 70% 乙醇萃之水層對細胞內 Cyclin B1、Cdc2與 p-Cdc2 (Thr161) 蛋白表現之影響 62 (二) 未照射舞菇 (NW) 與脈衝光照射舞菇 (IW) 70% 乙醇萃之水層對細胞內 Cdc25C 蛋白表現之影響 64 (三) 未照射舞菇 (NW) 與脈衝光照射舞菇 (IW) 70% 乙醇萃之水層對細胞內 p53 蛋白表現之影響 67 結論 72 參考文獻 73 附錄 8