探討NbXRN4與竹嵌紋病毒的複製能力之相關性

竹嵌紋病毒 (Bamboo mosaic virus, BaMV) 為單一正股RNA病毒，基因體全長約6.4 Kb。由於病毒基因體所能攜帶的遺傳訊息有限，其生活史需要宿主蛋白質因子 (Host factors) 的共同參與，因此本實驗室利用農桿菌滲入法 (agro-infiltration) 於菸草中表現BaMV複製酵素。接著以專一性抗體針對BaMV複製複合體 (BaMV replication complex) 進行分離。根據這套方法，再配合液態層析串聯質譜儀 (LC/MS/MS) 進行蛋白質身份鑑定後，找到了二十二個可能與BaMV replication complex組成有關的菸草蛋白質。利用菸草脆裂病毒 (Tobacco rattle virus) 進行基因靜默法 (virus-induced gene silencing, VIGS) 調降特定基因的表現量。待特定基因調降後，接種攜帶綠色螢光蛋白質 (green fluorescent protein, GFP) 基因的BaMV病毒顆粒 (virions)，藉由影像分析GFP在葉片上的累積，觀察病毒複製與移動情況。經多次測試後，挑選出顯著影響複製的圓葉菸草蛋白質： 5'-3' exonuclease (XRN4)。進一步利用西方墨點法 (Western Blot)偵測GFP累積量，結果和影像分析一樣減少GFP的累積量。也利用北方墨點法 (Northern Blot) 探討BaMV的基因體 (genomic) RNA以及次基因體 (subgeomic) RNA以及siRNA的累積量差異。此外也使用生物資訊方式，對比不同資料庫，尋找目標基因全長片段。為了在菸草上獲得基因全長片段，將菸草葉片萃取RNA後，反轉錄成cDNA，設計引子 (primer) 增幅目標基因全長片段後，將之構築於菸草表現載體pBI221上。利用CaMV 35S啟動子，於菸草原生質體接種系統 (protoplast transformation) 中大量表現NbXRN4，可以觀察病毒外鞘蛋白質累積量上升了40%。未來將進一步確定BaMV 複製酵素與目標蛋白質在細胞間的共存 (co- localization) 關係。Bamboo mosaic virus (BaMV) is a 6.4-Kb positive-sense RNA virus. It depends on the host factors for replication and movement. Nicotiana benthamiana infiltrated with Agrobacterium that carries the viral polymerase-coding region was used to produce BaMV replication complex, which was then isolated by Immunoprecipitation using specific antibodies. Twenty-two hypothetical host factors in the complex were identified by LC tandem mass spectrometry. The expression of the potential factors in N. benthamiana were downregulated by the TRV-induced gene silencing method and the silenced plant was subsequently inoculated with the recombinant BaMV virion that carries GFP gene to assess the effects of the factors on BaMV replication. Among the potential factors, silence of NbXRN4, confirmed by the RT-PCR method, significantly reduced the expression of GFP, as evidenced by the green fluorescent spots, on the leaves that had been inoculated with the recombinant BaMV. The expression of GFP in the inoculated leaves was examined by Western blot, and the result confirmed that the accumulation of GFP was decreased in the NbXRN4-silenced plant. Northern blot also indicated that the accumulation of genomic and subgenomic RNAs of BaMV was decreased in NbXRN4-silenced plant. The putative nucleotide sequence of NbXRN4 cDNA was assembled according to the various EST data. In order to obtain the cDNA in full length, specified primers were designed to amplify the gene and put it into pBI221 expression vector. Overexpression of NbXRN4 in N. benthamiana protoplasts significantly increased the viral coat protein accumulation. Next, we expect to make sure the co-localization of the BaMV RdRP and NbXRN4 in plant cell.致謝 i 摘要 ii Abstract iii 目次 iv 圖表目次 vi 壹、前言 1 一、竹嵌紋病毒 1 二、宿主與病毒的交互關係 2 三、竹嵌紋病毒宿主因子研究 4 四、實驗研究背景 5 五、實驗目的 6 貳、材料與方法 7 一、菸草脆裂病毒誘導之基因靜默 7 (一) pTRV2-putative host factor之構築 7 (二) 農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens C58C1)勝任細胞製備及轉型作用 (transformation) 8 (三) 農桿菌接種 9 (四) 基因靜默分析 10 二、BaMV-GFP 病毒顆粒接種 10 (一) GFP影像分析 11 (二) BaMV鞘蛋白 (coat protein, CP) 累積量分析 11 (三) 西方墨點法 (BaMV報導基因之偵測) 12 三、其他病毒顆粒接種測試 13 (一) 狐尾草嵌紋病毒 (Foxtail mosaic virus, FoMV) 病毒顆粒接種 13 (二) 馬鈴薯嵌紋病毒 (Potato virus X, PVX) 病毒顆粒接種 13 四、過量表現NbXRN4在菸草原生質體之感染系統 13 (一) 質體構築 13 (二) 大腸桿菌 (Escherichia coli)勝任細胞製備及轉型作用(transformation) 14 (三) 大量質體DNA之製備 15 (四) 菸草原生質體之感染系統 15 (五) 病毒鞘蛋白含量分析 17 五、北方轉漬分析法 17 (一) 竹嵌紋病毒 17 (二) 小干擾RNA 20 參、結果 24 一、圓葉菸草可能性宿主因子基因靜默後，GFP累積量分析 24 二、NbXRN4靜默之圓葉菸草對於竹嵌紋病毒之分析 24 (一) 菸草基因靜默植株表徵型態之影響 24 (二) NbXRN4靜默分析 25 (三) NbXRN4靜默植株之GFP累積量分析 25 (四) NbXRN4靜默植株之FoMV CP以及PVX CP之西方墨點法分析 26 (五) NbXRN4靜默植株之BaMV核酸分析 26 (六) NbXRN4靜默植株之BaMV小干擾RNA分析 26 三、圓葉菸草XRN4對於竹嵌紋病毒之影響 27 (一) NbXRN4核酸序列全長找尋 27 (二) 原生質體系統 28 肆、討論 29 一、潛在宿主因子討論 29 二、XRN4探討分析 30 (一) XRN生物功能 30 (二) XRN4與病毒的關係 30 三、siRNA累積量探討 31 四、總結 31 參考文獻 33 圖表 4