表現及純化Escherichia coli uridine phosphorylase以研究三磷酸腺苷對其穩定度的影響

尿苷磷酸化酶(Uridine phosphorylase)是核酸回收再利用途徑中重要的酵素之一，此酵素的受質為尿苷、磷酸鹽、尿嘧啶和核糖 1-磷酸。先前的研究發現，三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate)似乎會對大腸桿菌細胞裂解液裡的尿苷磷酸化酶造成去穩定化(apparent destabilization)的作用，造成此現象的原因有可能為三磷酸腺苷透過與尿苷磷酸化酶的中介態結合所導致，另外三磷酸腺苷也有可能經由此作用影響到尿苷磷酸化酶的摺疊過程，進一步影響到此酵素的生物功能。為了瞭解小分子三磷酸腺苷對此酵素的詳細作用機制，我們設計了一系列的實驗以確認此作用是否透過小分子對蛋白質中介態的影響而造成。 為了排除其它因素影響到三磷酸腺苷對尿苷磷酸化酶之間的作用，首先需取得純化後的尿苷磷酸化酶。以分子選殖的方式，我們成功的把載體pET28b跟尿苷磷酸化酶的基因接合在一起；另外，我們也成功的在E.coli BL21(DE3)中大量的表現尿苷磷酸化酶；藉由結合DEAE sepharose Fast Flow管柱和His-tagged管柱的分離效果，我們取得純化後以尿苷磷酸化酶為主的蛋白質樣品。以pulse proteolysis對此蛋白質的穩定度進行實驗。結果顯示，三磷酸腺苷對尿苷磷酸化酶確實有去穩定化的作用。Uridine phosphorylase(upase)is an important enzyme in the nucleotide salvage pathway. The substrates of this enzyme include uridine,phosphate,uracil and ribose 1-phosphate. Previous studies showed that E.coli upase seems apparently destabilized in the presence of adenosine triphosphate(ATP). The possible mechanism of this phenomenon may come from the interaction between ATP and the intermediate state of upase. In addition,this interaction may change the folding pathway of upase which can possibly be correlated to the the biological function of this enzyme. To understand the detail mechanism of this interaction,we have designed a series of experiments to study the effect of ATP on the intermediates of upase. First,we tried to purify upase in order to rule out factors that may complicate the interaction between ATP and upase. Cloning experiments successfully incorporated the gene of upase into pET28b plasmid. We then over-expressed upase in E.coli BL21(DE3). By combining DEAE sepharose Fast Flow and His-tagged affinity chromatography,we purified the E.coli upase as dominating protein. Finally,We measured the thermodynamic stability of upase in the presence or absence of ATP by pulse proteolysis. The results show that ATP apparently destabilizes the E.coli upase .中文摘要 i Abstract ii 目次 iii 表目次 vi 圖目次 vii 壹、動機 1 貳、文獻回顧 3 一、蛋白質穩定度 3 (一) 穩定度定義 3 (二) 摺疊態蛋白質 3 (三) 不摺疊態蛋白質 3 (四) 蛋白質穩定度的重要性 3 (五) 測蛋白質穩定度的方法 4 二、三磷酸腺苷 5 (一) 基本特性 5 (二) 生理功能 6 三、尿苷磷酸化酶 7 (一) 尿苷磷酸化酶的基本資料 7 (二) 在不同種生物之間尿苷磷酸化酶胺基酸比對的結果 8 (三) 尿苷磷酸化酶的結構 8 (四) 核苷磷酸化酶-Ι家族的相似性 9 (五) 尿苷磷酸化酶在醫療上的價值 10 四、蛋白質表現跟純化 10 (一) 表現蛋白質是必需的 10 (二) 純化蛋白質是必需的 10 參、材料與方法 12 一、實驗大綱 12 二、Escherichia coli BL21(DE3)尿苷磷酸化酶分子選殖 13 (一) 聚合酶鏈鎖反應放大E.coli BL21(DE3)尿苷磷酸化酶基因 13 (二) 載體萃取 14 (三) 限制酶NdeΙ跟BamHΙ-HF剪切 14 (四) 膠體電泳 14 (五) gel extraction 15 (六) 接合 15 (七) 轉形 16 (八) 藉由NdeΙ跟BamHΙ-HF來確認接合有無成功 16 三、E.coli BL21(DE3)尿苷磷酸化酶蛋白質表現跟純化 17 (一) 接合成功的質體轉形進E.coli BL21(DE3) 17 (二) 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導蛋白質大量表現 17 (三) 破菌 17 (四) 離心 18 (五) 透析 18 (六) 以DEAE sepharose Fast Flow管柱純化 19 (七) 透析 20 (八) 以His-tagged 管柱純化 21 (九) 透析 22 四、E.coli BL21(DE3)尿苷磷酸化酶蛋白質穩定度測量 23 (一) pulse proteolysis的材料 23 (二) pulse proteolysis的儀器 23 (三) pulse proteolysis的方法 23 肆、結果與討論 26 一、Escherichia coli BL21(DE3)尿苷磷酸化酶分子選殖 26 (一) 聚合酶鏈鎖放大E.coli BL21(DE3)尿苷磷酸化酶基因 26 (二) 載體pET28b萃取 27 (三) 限制酶NdeΙ跟BamHI-HF剪切pET28b和尿苷磷酸化酶的聚合酶鏈鎖產物 28 (四) Gel extraction 29 (五) 接合(ligation)後轉形(transformation)的結果 29 (六) 用限制酶NdeI跟BamHI-HF確認接合成功與否 30 (七) 用限制酶NdeI跟BamHI-HF確認只有載體組的實驗結果 31 (八) 定序的結果 33 (九) 接合的效率低 33 二、Escherichia coli BL21(DE3)尿苷磷酸化酶表現跟純化 35 (一) E.coli BL21(DE3)轉形出來的菌數 35 (二) 菌數定量 35 (三) 膠片結果 35 (四) DEAE sepharose Fast Flow管柱純化 36 (五) 膠片結果 37 (六) His-tagged管柱純化 38 (七) 定量 39 (八) 得到更純的his-tagged 尿苷磷酸化酶的純化方法 39 三、Escherichia coli BL21(DE3)尿苷磷酸化酶的穩定度 40 (一) 尿苷磷酸化酶貯存液定量 40 (二) 溶液A跟溶液B混製成反應的方法的結果分析 40 (三) 最後加尿素製成反應的方法的結果分析 42 (四) 兩種方法的控制組結果比較 45 (五) 三磷酸腺苷對E.coli BL21(DE3)尿苷磷酸化酶的穩定度影響 45 (六) Thermolysin的切點 47 (七) 估算在his-tagged 尿苷磷酸化酶上形成剪切態的切位 47 伍、結論 48 陸、參考文獻 8