STUDIO NO MATTER (NOVEL MARKERS FOR PATENT DUCTUS ARTERIOSUS RESPONSE TO DRUGS): NUOVI INDICATORI DI RISPOSTA ALLA TERAPIA FARMACOLOGICA DEL DOTTO DI BOTALLO PERVIO

ABSTRACT (English version below) BACKGROUND La pervietà del Dotto di Botallo ha un’incidenza di 1/2000 nei neonati a termine, ma può interessare fino al 60% dei neonati pretermine. Le sue conseguenze includono iperafflusso polmonare, dilatazione delle sezioni cardiache sinistre, diminuzione della portata cardiaca periferica, con possibili gravi complicanze tra cui insufficienza cardiaca, NEC, distress respiratorio, broncodisplasia polmonare ed IVH. Le evidenze sperimentali indicano la prostaglandina E2 come principale agente vasodilatatore del dotto, e per questo la terapia farmacologica del PDA si fonda attualmente sull’impiego di inibitori della sintesi di prostaglandine (ibuprofene, indometacina o paracetamolo), la cui necessità viene valutata sulla base di criteri clinici, biochimici ed ecocardiografici e si fonda su una complessa analisi del rapporto rischi-benefici, anche a causa dei possibili effetti collaterali dei farmaci. Recenti evidenze suggeriscono inoltre la presenza di un meccanismo fisiopatologico più complesso, in cui potrebbero avere un ruolo critico anche ossido nitrico e mediatori dello stress ossidativo: alcuni autori, pertanto, hanno ipotizzato che l’efficacia terapeutica dell’ibuprofene possa in parte dipendere anche dalla sua capacità di eliminare le specie reattive di ossigeno e azoto. In ogni caso, una serie di studi sottolinea l’ampia variabilità inter-individuale di risposta al trattamento farmacologico ed il 20-30% dei pazienti richiede un intervento chirurgico di legatura poiché non mostra alcuna risposta ai farmaci. OBIETTIVI DELLO STUDIO Obiettivo primario: in questo studio pilota utilizziamo metodi biochimici per studiare la vasocostrizione del dotto di Botallo nei neonati pretermine. In particolare, intendiamo valutare i marcatori dello stress ossidativo (15-F2t-IsoP e 15-E2t-IsoP), indici di funzionalità renale (creatinina), la concentrazione del farmaco usato per il trattamento (ibuprofene) ed il suo target prostaglandina E2 nei neonati pretermine con PDA, e misurarne le variazioni indotte dalla terapia farmacologica e/o chirurgica al fine di poter stabilire dei cut-off dei livelli di tali marcatori, che consentano di prevedere, attraverso una analisi multivariata, la risposta individuale ai farmaci e identificare in anticipo i pazienti non-responder. Obiettivi secondari: ampliare le conoscenze sui complessi meccanismi del PDA, in particolare il suo rapporto con lo stress ossidativo; stabilire protocolli analitici affidabili per l’analisi degli spot di sangue; stabilire se è presente associazione tra il PDA ed altre comorbilità legate alla prematurità (ROP, O2-dipendenza, problematiche alimentari, ospedalizzazione). MATERIALI E METODI Criteri di inclusione: età gestazionale <32 settimane e/o peso alla nascita ≤ 1500 g; PDA emodinamicamente significativo; Consenso informato scritto da parte dei genitori. Criteri di esclusione: presenza di malformazioni complesse e/o sindromi genetiche. La raccolta del campione consiste in una deposizione volumetrica di singolo spot di sangue (50 μL) su carta pretrattata, con campionamento alla nascita (T0), a 72 ore di vita (T1), a 36 settimane di età post-mestruale (T2) ed in relazione a diagnosi e trattamento (alla diagnosi ecocardiografica, per ogni giorno di trattamento e 24 ore prima e dopo eventuale intervento chirurgico). Lo spot di sangue è stato analizzato tramite cromatografia sia con metodo target che con metodo target screening. RISULTATI Sono stati arruolati nello studio 32 neonati, dei quali 8 (25%) con PDA richiedente trattamento farmacologico. I neonati che hanno sviluppato il PDA hanno mostrato un’età gestazionale media inferiore (p < 0.001) ed un minor peso alla nascita (p < 0.001). Tutti i neonati con dotto arterioso pervio sono stati trattati con ibuprofene con soddisfacente risposta terapeutica, senza necessità di ricorso a terapia chirurgica. Gli isoprostani 15-F2t-IsoP e 15-E2t-IsoP, PGE2, creatinina ed ibuprofene sono stati ricercati tramite metodo cromatografico su spot di sangue raccolti nei tempi di campionamento previsti nel disegno dello studio. Non sono state evidenziate differenze statisticamente significative sulla concentrazione di 15-F2t-IsoP, 15-E2t-IsoP e PGE2 tra il gruppo dei controlli ed il gruppo dei casi al T0 e T1. All’interno del gruppo dei neonati con PDA non è stato individuato un trend in diminuzione complessivo della concentrazione dei marcatori di stress ossidativo e di prostaglandina E2. Tuttavia, analizzando singoli pazienti del gruppo dei casi è stato dimostrato un trend in diminuzione, durante trattamento con ibuprofene, di PGE2 e di isoprostani 15-F2t-IsoP e 15-E2t-IsoP. Estendendo la ricerca analitica con metodo target screening sono stati individuati altri composti appartenenti alla famiglia delle ossilipine (EETs-HETEs) che hanno mostrato un trend in decremento all’interno del gruppo dei pazienti con PDA, durante trattamento farmacologico con ibuprofene. Il gruppo di neonati con PDA ha richiesto trattamento con steroidi e tempi più prolungati di ventilazione non invasiva, di O2-terapia, di raggiungimento del full enteral feeding e di recupero del peso alla nascita, con significatività statistica (p < 0.05) rispetto al gruppo dei controlli. Non sono state osservate differenze statisticamente significative tra i due gruppi nell’incidenza di ROP e nei giorni di ospedalizzazione. CONCLUSIONI I risultati preliminari non hanno suggerito una significativa differenza di concentrazione dei metaboliti vasoattivi 15-F2t-IsoP e 15-E2t-IsoP nei pazienti con PDA rispetto ai controlli. Risultati interessanti sono stati evidenziati attraverso l’analisi con metodo target screening, tramite l’individuazione di ossilipine derivanti dalla lipossigenasi (EETs e HETEs), che hanno mostrato trend decrescenti nel tempo in concomitanza con la chiusura del dotto. Sono previste ulteriori indagini per confermare il ruolo di questa classe di composti vasoattivi nella chiusura del PDA su una coorte più ampia di soggetti. BACKGROUND The Patent ductus arteriosus has an incidence of 1/2000 in term infants, but can affect up to 60% of preterm infants. Its consequences include pulmonary hyper-influx, dilatation of left heart sections, decreased peripheral heart flow, with possible serious complications including heart failure, NEC, respiratory distress, bronchopulmonary Dysplasia and IVH. Experimental evidence points to prostaglandin E2 as the main vasodilator agent of the duct, and for this reason PDA drug therapy is currently based on the use of prostaglandines synthesis inhibitors (ibuprofen, indometacin or paracetamol), the need for which is assessed on the basis of clinical, biochemical and echocardiographic criteria and it is based on a complex analysis of the risk-benefit ratio, also due to the possible effects of the drugs. Recent evidence also suggests the presence of a more complex physiopathological mechanism, in which nitric oxide and oxidative stress mediators could also play a critical role: some authors have therefore hypothesized that the therapeutic efficacy of ibuprofen may also partly depend on its ability to eliminate reactive oxygen and nitrogen species. In any case, a number of studies emphasize the wide inter-individual variability of response to drug treatment and 20-30% of patients require ligature surgery due to no response to drugs. STUDY OBJECTIVES Primary objective: In this pilot study, we use biochemical methods to study the vasocostrition of the ductus arteriosus in preterm newborns. In particular, we intend to evaluate oxidative stress markers (15-F2t-IsoP and 15-E2t-IsoP), kidney function indicator (creatinine), the concentration of the drug used for treatment (ibuprofen) and its prostaglandin E2 target in preterm infants with PDA, and measure their variations induced by drug and/or surgical therapy in order to be able to establish cut-offs of the levels of these markers, which allow to predict, through a multivariate analysis, the individual response to drugs and identify in advance non-responder patients. Secondary objectives: increase knowledge about the complex mechanisms of the PDA, in particular its relationship with oxidative stress; establishing reliable analytical protocols for the analysis of blood spots; establish whether there is an association between the PDA and other comorbidities related to prematurity (ROP, O2-dependence, feeding intolerance, hospitalization). MATERIALS AND METHODS Inclusion criteria: gestational age <32 weeks and/or birth weight ≤ 1500 g; Hemodynamically significant PDA; Informed consent written by parents. Exclusion criteria: the presence of complex malformations and/or genetic syndromes. The collection of the sample consists of a volumetric deposition of a single blood spot (50 μL) on pretreated paper, with sampling at birth (T0), at 72 hours of life (T1), at 36 weeks of post-menstrual age (T2) and in relation to diagnosis and treatment (to ultrasound diagnosis, for each day of treatment and 24 hours before and after possible surgery). The blood spot was analyzed using chromatography using both target method and target screening method. RESULTS 32 newborns were enrolled in the study, of which 8 (25%) PDA requesting drug treatment. Infants who developed PDA showed a lower average gestational age (p < 0.001) and lower birth weight (p < 0.001). All infants with Patent ductus arteriosus were treated with ibuprofen with therapeutic response, without the need for surgical therapy. Isoprostanes 15-F2t-IsoP and 15-E2t-IsoP, PGE2, creatinine and ibuprofen were researched by chromatographic method on blood spots collected at the sampling times expected in the study design. No statistically significant differences were found on the concentration of 15-F2t-IsoP, 15-E2t-IsoP and PGE2 between the control group and the case group at T0 and T1. Within the group of infants with PDA, an overall decrease in the concentration of oxidative stress and prostaglandin E2 markers was not identified. However, analysing individual patients in the case group showed a decreasing trend during treatment with ibuprofen, PGE2 and isoprostanes 15-F2t-IsoP and 15-E2t-IsoP. Extending the analytical research with target screening method, other compounds belonging to the family of oxylipins (EETs-HETEs) were identified and they showed a decreasing trend within the group of patients with PDA, during drug treatment with ibuprofen. The group of infants with PDA required steroid treatment and longer times of non-invasive ventilation, O2-therapy, in achieving full enteral feeding and birth weight recovery, with statistical significance (p < 0.05) than the control group. No statistically significant differences were observed between the two groups in the incidence of ROP and in hospitalization days. CONCLUSIONS Preliminary results did not suggest a significant difference in concentration of vasoactive metabolites 15-F2t-IsoP and 15-E2t-IsoP in PDA patients compared to controls. Interesting results were highlighted through target screening analysis, through the detection of oxylipins derived from lipoxygenase (EETs and HETEs), which showed decreasing trends over time during the closure of the ductus arteriosus. Further investigations are planned to confirm the role of this class of vasoactive compounds in closing the PDA on a larger cohort of subjects