Valutazione di mutazioni somatiche nel DNA estratto da liquido pleurico e plasma in pazienti con Mesotelioma Pleurico Maligno(MPM)

Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è una patologia rara e letale, la cui insorgenza è determinata dall’esposizione all’asbesto. Negli ultimi anni l’elevata incidenza di casi di MPM ha condotto la ricerca verso l’individuazione di biomarcatori specifici in grado di consentire una immediata diagnosi. Negli ultimi anni è stato accertato che i fluidi corporei (in particolare il plasma) possono contenere minime tracce di DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) derivante dalle neoplasie e questi frammenti di DNA mutante possono costituire una preziosa risorsa per fornire informazioni sul tumore stesso, al fine di eseguire una diagnosi più accurata, effettuare un follow-up clinico più preciso o per scegliere trattamenti terapeutici personalizzati. In futuro le cosiddette “biopsie liquide” potranno giocare un ruolo sempre più importante per la medicina personalizzata. Alcuni tipi tumorali quali per esempio l’epatocarcinoma, sono particolarmente efficaci nel rilasciare ctDNA nel plasma. Altri, quali p.e.s il glioblastoma sembrano avere più difficoltà e sono meno facilmente analizzabili con le biopsie liquide. La presente tesi ha lo scopo di affrontare questo ultimo aspetto. Abbiamo infatti valutato se il liquido pleurico e il plasma di pazienti con MPM presentino ctDNA, in che quantità, e se esso sia in grado di fornire informazioni utili sullo stato mutazionale del tumore. La verifica di queste informazioni permetterebbe di comprendere se liquido pleurico e il plasma possano essere campioni biologici utili per effettuare analisi basate su “biopsie liquide” (LB). A corollario di questa indagine abbiamo anche cercato di comprendere se il panorama mutazionale dell’MPM analizzato mediante biopsie liquide possa essere di supporto per velocizzare una eventuale diagnosi. La casistica da noi utilizzata è derivata da 3 banche biologiche, una proveniente dall’Ospedale San Martino di Genova (IRCCS, ex Istituto Tumori), una dall’Ospedale Universitario di Cisanello (Pisa) e una dal Dipartimento di malattie toraciche dell’Ospedale della Facoltà di Medicina dell’Università Eskişehir Osmangazi della Turchia. Le biopsie tumorali dei 32 pazienti da noi raccolti sono state sottoposte a whole-exome sequencing (WES) in parallelo al loro campione ematico, là dove disponibile. Mediante vari metodi di filtraggio sono state quindi identificate le putative mutazioni somatiche. Alcune delle variazioni a singolo nucleotide (fino a un massimo di 4 single nucleotide variations, SNV, per paziente) sono state utilizzate per tracciare il DNA tumorale nei fluidi a disposizione (liquido pleurico e/o plasma). Una prima verifica della reale esistenza delle mutazioni prescelte è stata effettuata tramite ASO q-PCR, tecnica non sensibile e semi-quantitativa ma economica. In seguito ad un eventuale riscontro positivo abbiamo utilizzato la più sensibile digital droplet PCR (ddPCR). Quest’ultima, infatti, permette di evidenziare e misurare con precisione, tra una moltitudine di sequenze di tipo wild-type, anche minime quantità di DNA mutante (0,1%) rilasciato dal tumore stesso ed eventualmente libero di circolare nei fluidi corporei. Ciascuna mutazione paziente-specifica è stata quindi tracciata mediante ddPCR nei fluidi a disposizione (liquido pleurico e/o il plasma) ottenuti dal paziente stesso. I risultati hanno dato alcune chiare indicazioni: (1) il liquido pleurico presenta una percentuale di DNA mutante molto simile al campione tumorale da cui proviene, indicando la possibilità che possa dare notevoli informazioni sul tumore, in maniera meno invasiva della biopsia (se presente effusione o essudato pleurico); (2) il plasma può presentare alcune mutazioni del tumore del paziente, ma in percentuali molto ridotte e non in tutti i pazienti; (3) è stato possibile confermare che nelle biopsie tumorali alcuni pazienti presentavano SNV in geni noti costituenti lo stato mutazionale del MPM (ad esempio BAP1 e LATS2), ma che la frequenza dei pazienti recanti tali mutazioni non superava il 10%; (4) non abbiamo ritrovato mutazioni ricorrenti tra i vari pazienti analizzati; (5) conseguenza dei punti 3 e 4: nella maggioranza dei casi l’analisi delle mutazioni di un numero ristretto di geni (meno di 20) non permette di identificare con certezza la presenza di un MPM (a meno che non insorga una mutazione in alcuni geni caratterizzanti quali BAP1, in LATS2 o in NF2). Complessivamente i dati indicano che il liquido pleurico è un tipo di campione biologico adatto per il monitoraggio dei pazienti con MPM mediante biopsie liquide, ma lasciano sperare che anche l’utilizzo del plasma possa dare utili informazioni sul tumore stesso qualora si riesca ad aumentare la sensibilità dei saggi