Papel del factor de crecimiento derivado de plaquetas bb en la distrofia muscular de duchenne en humanos y estudio de nintedanib como tratamiento de un modelo murino de déficit de distrofina

Departament responsable de la tesi: Departament de Medicina.La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un tipo de distrofia muscular de origen genético que se caracteriza por una degeneración muscular a causa de la deficiencia distrofina, una proteína del citoesqueleto involucrada en la estabilización del sarcolema. Esta enfermedad es caracterizada por una debilidad muscular rápida y progresiva que aparece a los 5-7 años e involucra los músculos proximales y las extremidades inferiores. El corazón y el sistema respiratorio también están afectados, resultando ser las principales causas de muerte. Desafortunadamente, no existe un tratamiento efectivo descrito hasta la fecha que haya cambiado sustancialmente la historia natural de la enfermedad. Desde el punto de vista fisiopatológico, la pérdida de distrofina lleva a un daño del sarcolema, infiltrados de células inflamatorias y necrosis de fibras musculares reemplazados por tejido adiposo y fibroso. Muchos factores contribuyen a este proceso, pero las vías moleculares relacionadas a la regeneración y la degeneración muscular no son completamente conocidas. Los factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) pertenecen a una familia de factores de crecimiento que regulan la proliferación, migración y diferenciación de células mesenquimales. Mientras que la isoforma PDGF-AA está asociada a fibrosis, el papel de la isoforma PDGF-BB en la regeneración muscular en humanos no ha sido estudiado. En este estudio se estudió la expresión de PDGF-BB en muestras de biopsia muscular de controles y pacientes con DMD. Para ello, se realizaron experimentos in vitro para entender los efectos de PDGF-BB en mioblastos, los cuales están involucrados en la patofisiología de las distrofias musculares. Estos resultados se confirmaron in vivo mediante el tratamiento del modelo murino mdx de DMD con inyecciones intramusculares repetidas de PDGF-BB durante 1 mes. Como resultado, se observó que PDGF-BB estaba expresado en las fibras musculares necróticas y regenerativas en muestras de biopsias musculares de pacientes con DMD. In vitro, PDGF-BB activó la proliferación y migración de mioblastos. El análisis de muestras musculares de ratón de animales tratados con PDGF-BB mostró un incremento en la población de células satélite (SCs) y en el número de fibras regenerativas, con una reducción en los infiltrados inflamatorios, en comparación con los animales tratados con vehículo. Basado en estos resultados, sugerimos que PDGF-BB podría jugar un papel protector en las distrofias musculares al mejorar la regeneración muscular a través de la activación de la proliferación y migración de las células satélite.Muchas terapias se han desarrollado para combatir el proceso fibrótico en distrofias musculares y otras enfermedades. En este trabajo se estudiaron los efectos de nintedanib, un triple inhibidor tirosina cinasa, en un modelo murino de DMD, el ratón mdx. Nintedanib redujo la proliferación y migración de fibroblastos humanos in vitro y disminuyó la expresión de genes fibróticos como COL1A1, COL3A1, FN1, TGFB1 y PDGFA. Siete ratones mdx fueron tratados con 60 mg/kg/día con nintedanib durante 1 mes. Estudios electrofisiológicos mostraron un incremento en la amplitud de los potenciales de acción motora y un mejoramiento de la morfología de los potenciales de unidad motora en los animales tratados. Estudios histológicos demostraron una reducción significativa de las áreas fibróticas presentes en los músculos esqueléticos. El análisis de la expresión de mRNA de músculos de ratón tratado indicó una reducción en los genes de Col1a1, Col3a1, Tgfb1 y Pdgfa. El western blot (WB) manifestó una reducción en la expresión de proteína del colágeno I en los músculos tratados. En conclusión, nosotros observamos que nintedanib ralentizó el proceso fibrótico muscular en un modelo murino de distrofinopatía después de 1 mes de tratamiento, sugiriendo su potencial papel como agente terapéutico en pacientes DMD.Duchenne muscular dystrophy (DMD) is genetic disorder characterized by a continuous muscle degeneration produced by the deficiency of dystrophin, which is a cytoskeletal protein involved in the stabilization of the sarcolemma. The disease is characterized by a rapidly progressive muscle weakness that appears at 5-7 years old involving the proximal muscles of the lower limbs. All patients lose the ambulation by the age of 12-15 and are completely dependent of their relatives after the 20 years of age. Cardiac and respiratory involvement is a constant, and they are the main causes of death. Unfortunately, there is not an effective treatment described so far that has changes substantially the natural history of the disease. From a pathophysiological point of view, dystrophin loss leads to sarcolemma damage, infiltrates of inflammatory cells and muscle fiber necrosis and replacement by fat and fibrotic tissue. Although several of the factors that contribute to this process have been revealed, the molecular pathways involved in the regeneration and degeneration of muscle are not completely known. Platelet derived growth factor (PDGF) belongs to a family of growth factors that regulate proliferation, migration, and differentiation of mesenchymal cells. While PDGF-AA isoform is associated to fibrosis, the role of PDGF-BB isoform in muscle regeneration in humans has not been studied. In this study it was analyzed the expression of PDGF-BB in muscle biopsy samples from controls and patients with DMD. Also, it was performed in vitro experiments to understand the effects of PDGF-BB on myoblasts, which are cells involved in the pathophysiology of muscular dystrophies and in vivo, by treating the mdx murine model of DMD with repeated intramuscular injections of PDGF-BB. As a result, it was observed that PDGF-BB was expressed by regenerating and necrotic muscle fibers in muscle biopsy samples from DMD patients. In vitro, PDGF-BB activated proliferation and migration of myoblasts. The analysis of muscles samples from the animals treated with PDGF-BB showed an increase in the population of satellite cells (SCs) and in the number of regenerative fibers, with a decrease in the inflammatory infiltrates, compared with those vehicle-treated mice. Based on these results, we suggest that PDGF-BB may play a protective role in muscular dystrophies by enhancing muscle regeneration through activation of satellite cell proliferation and migration. Several therapies have been developed to counteract the fibrotic process in muscle dystrophies and other diseases. In this study the effects of nintedanib, which is a triple tyrosine kinase inhibitor, in the mdx murine model of DMD were investigated. Nintedanib reduced proliferation and migration of human fibroblasts in vitro and decreased the expression of fibrotic genes such as COL1A1, COL3A1, FN1, TGFB1 and PDGFA. Seven mdx mice were treated with 60 mg/kg/day nintedanib for 1 month. Electrophysiological studies showed an increase in the amplitude of the motor action potentials and an improvement of the morphology of motor unit potentials in the animals treated. Histological studies demonstrated a significant reduction of the fibrotic areas present in the skeletal muscles. Analysis of mRNA expression from muscles of treated mice showed a reduction in Col1a1, Col3a1, Tgfb1, and Pdgfa. Western blot showed a reduction in the expression of collagen I in skeletal muscles. In conclusion, we observed that nintedanib slowed down the process of muscle fibrosis in a murine model of dystrophinopathy after 1 month of treatment, suggesting its potential role as a therapeutic agent in DMD patients