Contribution of histone modifications to double-strand break repair and aging

Departament responsable de la tesi: Departament de Biologia Cel·lular, de Fisiologia i d'Immunologia.El mantenimiento de la integridad del DNA es fundamental para evitar la aparición de mutaciones. Entre los diferentes tipos de daños en el DNA a los que la célula debe enfrentarse, destacan las roturas de la doble cadena del DNA (DSBs). La regulación de la respuesta al daño depende en gran medida del estado de la cromatina. En este sentido resultan de especial interés la oxidación de la histona 3 en la lisina 4 (H3K4ox) y la acetilación de la histona 4 en la lisina 16 (H4K16Ac). H3K4ox se ha relacionado recientemente con la señalización de la respuesta al daño. Por otro lado, la deacetilación de H4K16 es necesaria para el reclutamiento de 53BP1 a los DSBs. Además, se han descrito cambios en los niveles de H4K16Ac durante el envejecimiento y la senescencia. Considerando que los DSBs se acumulan con la edad, nos propusimos estudiar cómo los cambios de estas marcas durante el envejecimiento podrían contribuir a la reparación de DSBs.A pesar de la relación entre H3K4ox y la condensación de la cromatina, se observó un descenso de los niveles globales de H3K4ox tras la inducción de senescencia por oncogenes (OIS) en fibroblastos BJ y durante el envejecimiento in vitro de fibroblastos humanos (HDFs). Asimismo, se determinó un descenso en la expresión de ambas oxidasas LOXL2 y LOXL1 en OIS y una disminución de LOXL1 en HDFs envejecidos. Aunque los niveles globales de H3K4ox disminuyeron en OIS, el análisis de H3K4ox en los foci de heterocromatina asociados a la senescencia (SAHF) mostró un aumento de los niveles de oxidación en estas regiones cromatínicas específicas.Los fibroblastos senescentes y los HDFs envejecidos in vitro mostraron también unos niveles de H4K16Ac más bajos que los de sus respectivas células control. Además, los bajos niveles de H4K16Ac respondían a un incremento en la expresión de las sirtuinas en OIS y a una reducción de la expresión de MOF durante el envejecimiento in vitro.A continuación, se investigó cómo los cambios de H4K16Ac asociados al envejecimiento podrían afectar al reclutamiento de 53BP1 a los DSBs. Para ello se analizó la colocalización entre 53BP1 y γH2AX y los niveles de H4K16Ac en HDFs jóvenes y envejecidos in vitro antes y después de la inducción de DSBs. En células no tratadas, el envejecimiento in vitro se correlacionó con una disminución de los niveles de H4K16Ac y con un menor reclutamiento de 53BP1 a los DSBs basales. Sin embargo, tras la inducción de DSBs, los niveles de H4K16Ac se redujeron ligeramente en los HDFs de pases tempranos y aumentaron en HDFs de pases más tardíos. El reclutamiento de 53BP1 siguió una tendencia similar a la descrita para H4K16Ac. Por lo tanto, tras la inducción de DSBs, H4K16Ac alcanzó un nivel estable, relacionado con un adecuado reclutamiento de 53BP1. Confirmando esta hipótesis, la hiperacetilación mediada por nicotinamida y tricostatina A no mejoró el reclutamiento de 53BP1. Además, la hipoacetilación de H4K16 mediante el silenciamiento de MOF se tradujo en una disminución de la colocalización entre 53BP1 y γH2AX.Nuestros resultados señalan a H3K4ox como una marca epigenética asociada al envejecimiento especialmente relevante en senescencia. Además, describimos que, tras la inducción de DSBs, H4K16Ac alcanza unos niveles concretos, necesarios para el reclutamiento de 53BP1 a los DSBs. Las células jóvenes alcanzan este nivel rápidamente disminuyendo sus niveles basales de acetilación. Sin embargo, la consecución de dicho nivel puede verse dificultada en células envejecidas, ya que parten de niveles basales de H4K16Ac considerablemente inferiores. Por lo tanto, H4K16Ac se erige como una marca clave en la regulación de la reparación de los DSBs durante el envejecimiento.To efficiently maintain genome integrity cells have evolved an intricate signaling network termed as DNA damage response (DDR). A proper function of the DDR is required to repair deleterious DNA lesions, such as DNA double-strand breaks (DSBs). During in vitro and in vivo aging, a persistent accumulation of DSBs has been reported, suggesting a decline of the DNA repair mechanisms with age. Recent studies have highlighted the relevance of histone modifications in the regulation of the DDR. This is the case of the oxidation of H3 at lysine 4 (H3K4ox) and the acetylation of H4 at lysine 16 (H4K16Ac). The novel mark H3K4ox has been associated with the regulation of the DDR signaling. Regarding H4K16Ac, it has been related to DSB repair since its deacetylation is required for 53BP1 recruitment to DSB sites. Additionally, H4K16Ac varies during aging and cellular senescence. In this study we analyze the age-associated changes of these marks and their contribution to age-related DSB accumulation. Although H3K4ox has been linked to heterochromatinization, our results showed a global reduction of H3K4ox in BJ fibroblasts displaying oncogene-induced senescence (OIS) and during in vitro aging of human dermal fibroblasts (HDFs). Accordingly, the expression levels of the oxidases LOXL2 and LOXL1 also suffered from a strong decrease in senescent fibroblasts while in in vitro aged HDFs only LOXL1 expression was reduced. Nonetheless, we described how, although global levels of H3K4ox were reduced after OIS, they specifically increased in senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Hence, our findings suggest a relationship between heterochromatin regions and H3K4ox, conferring it a potential role in SAHF assembly and gene silencing during senescence. Similarly to H3K4ox, a global reduction of H4K16Ac was found in both senescent BJ fibroblasts and in vitro aged HDFs in comparison to the levels of their control counterparts. Our results indicated that the decrease of H4K16Ac was stablished through different molecular mechanisms in each process: while an increase in deacetylase activity was related to a higher expression of sirtuins in OIS, during in vitro aging the acetyltransferase activity was reduced due to decreased MOF expression. Next, we analyzed the presence of 53BP1 at үH2AX foci along with H4K16Ac levels in the whole nucleus before and after DSB induction in young and aged HDFs. In untreated in vitro aged cells, the decrease in H4K16Ac levels correlated with a reduction in 53BP1 recruitment to basal үH2AX-labelled DSBs. Strikingly, following DSB induction, H4K16Ac slightly decreased in early passage HDFs while it increased in late passage HDFs. The same tendency was observed regarding 53BP1 recruitment to DSBs which prompted us to speculate that a relation might exist between H4K16Ac levels and efficient 53BP1 recruitment to DSBs. H4K16 hyperacetylation using both nicotinamide and trichostatin A failed to ameliorate the recruitment of 53BP1 to DSBs; instead, H4K16 hypoacetylation by MOF depletion impaired 53BP1 recruitment to γH2AX-labelled DSBs. Thus, our results suggest that a specific H4K16Ac level should be reached for proper 53BP1 recruitment to DSBs. In summary, we report H3K4ox as a promising age-associated epigenetic modification. Indeed, its specific enrichment in SAHF indicates a prominent role for H3K4ox in senescence. Regarding H4K16Ac, our data suggest that following DSB induction, H4K16Ac reaches a specific level required for the recruitment of 53BP1 to DSB sites. In young cells, this level is rapidly reached by slightly lowering their basal levels of H4K16Ac. However, aged cells start from lower basal levels of H4K16Ac that might impede them to reach the optimum H4K16Ac level for proper 53BP1 recruitment. Consequently, H4K16Ac stands as a key mark in the regulation of DSB repair during aging