ß-lactam resistance in streptococcus spp.: a new resistance determinant murE

Der erhebliche Anstieg an Penicillin-resistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweit immer größer werdendes Problem in der Medizin dar. Für die Bekämpfung solcher resistenten Stämme ist es wichtig, die Entstehung und den Mechanismus der Penicillin-Resistenz auf molekularer Ebene zu verstehen und dadurch Targets für neue Klassen antimikrobieller Wirkstoffe zu identifizieren. Die Lösung dieser Problemstellung war somit der Schwerpunkt der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit. Die Arbeit befasste sich mit der Übertragung der beta-Laktam-Resistenz von einem hochresistenten klinischen S. oralis Isolat aus Ungarn auf den sensitiven S. pneumoniae R6 Stamm. Dabei sollte durch Transformationsexperimente überprüft werden, ob und wie weit S. oralis als Donor für die Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae fungieren kann und welche Gene dabei eine Rolle spielen. Solche Experimente bilden die Grundlage für das bessere Verständnis der Evolution und Ausbreitung der beta-Laktam-Resistenz in kommensalen und pathogenen Streptokokken. Durch sukzessive DNA-Transformation konnte der Resistenzphänotyp des Donorstammes zu einem hohen Grad in den sensitiven S. pneumoniae Stamm R6 übertragen werden. Von Interesse war zunächst, welche S. oralis PBPs dabei eine Rolle spielen. Für die bekannten Resistenzdeterminanten PBP2x, PBP2b und PBP1a konnte nachgewiesen werden, dass sie auch hier einen entscheidenden Beitrag für die Resistenzentwicklung leisten. Nach insgesamt sechs aufeinanderfolgenden Transformationsstufen mit chromosomaler S. oralis DNA konnte das Resistenzniveau des Rezipienten ca. 600- bis 700-fach erhöht werden; PBPs waren nur bei den ersten drei Stufen beteiligt. Microarray-Analysen mit DNA der Transformanten gaben Hinweise darauf, welche anderen Gene übertragen wurden und erlaubten in einem Fall die Identifizierung einer neuen Resistenzdeterminante: MurE. Die gesamte Resistenz des Donors konnte nicht in S. pneumoniae übertragen werden; die Gründe hierfür sind denkbar vielfältig und wurden in der Diskussion aufgegriffen. Die Charakterisierung der Nicht-PBP-Resistenzdeterminate MurE standen nach deren Identifizierung im Mittelpunkt der Analysen in der vorliegenden Arbeit. Die Selektion von beta-Laktam-resistenten Transformanten mit modifiziertem MurE zeigten zum ersten Mal die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung der Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae. Austausche in diesem Gen führten zu einer ca. 3- bis 5-fachen Erhöhung der Resistenz gegenüber Cefotaxim und Piperacillin und bewirkten einen 40-fachen Anstieg der Cefotaxim-Resistenz und 20-fachen Anstieg der Oxacillin-Resistenz in Verbindung mit einem Mosaik-PBP2x. In Verbindung mit einem Mosaik-PBP2b führte das ausgetauschte MurE zu einem 20-fachen Anstieg der Piperacillin-Resistenz. Durch Herstellung von Stämmen mit ektopischer Kopie von murE mit unterschiedlichen Promotor- und Genfragmenten und anschließender Deletion des Wildtyp-Allels im Genom konnte nachgewiesen werden, dass sowohl veränderte Bereiche im Strukturgen als auch der murE-Promotorbereich von S. oralis Uo5 zu einem Anstieg der Resistenz in S. pneumoniae führen. Einige der Veränderungen, die Aminosäuren betreffen, sind in der Nähe des aktiven Zentrums lokalisiert und könnten die Bindung zum Substrat bzw. ATP beeinflussen. Die Bestimmung der Promotoraktivität von murE aus S. oralis Uo5 und S. pneumoniae R6 ergab, dass das Gen aus S. oralis etwa zweifach stärker exprimiert wird. Die stärkere Expression von murE hat allerdings keinen Einfluss auf die Produktion von PBP2x, PBP1a oder PBP2b, wie durch spezifische Antikörper und Western-Blots für alle drei PBPs festgestellt werden konnte. Dies konnte auch mit Hilfe von Reporter-Assays zur Bestimmung der Promotoraktivität von pbp2x bestätigt werden. Signifikante Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung der murE-Transformanten konnten ebenfalls nicht beobachtet werden. Eine Hypothese geht davon aus, dass sowohl die erhöhte Promotoraktivität als auch die Mutationen im Strukturprotein dasselbe bewirken, nämlich die Bereitstellung von mehr MurE-Produkt (durch mehr Enzym oder durch aktiveres Enzym). Möglicherweise ist dadurch der Pool an Muropeptidvorstufen erhöht, was wiederrum Einfluss auf die Mureinbiosynthese hat und somit ein besseres Wachstum in Gegenwart von beta-Laktamen erlaubt, d.h. unter den hier verwendeten Selektions- und Testbedingungen