Production d'un peptide antigénique par l'insulin-degrading enzyme

Most antigenic peptides recognized by CD8 T lymphocytes are produced through degradation of intracellular proteins by the proteasome. However, some antigenic peptides are produced by a proteasome-independent pathway, which is poorly characterized. MAGE-A3168-176 is a tumor antigenic peptide presented by HLA-A1 and widely used for vaccination of melanoma patients. We observed that proteasome and tripeptidyl peptidase inhibitors failed to block presentation of the antigen by tumor cells. However, processing of this peptide occured in the cytosol because TAP-inhibition prevented its presentation. To characterize the cytosolic peptidase producing MAGE-A3168-176 we setup an in vitro digestion assay using a 20-mer precursor peptide encompassing the sequence of the antigenic peptide. We observed that only the cytosolic fraction was able to produce the antigenic peptide from this precursor. This production was abolished by treating the cytosolic fraction with o-phenanthroline, a broad-spectrum inhibitor of metallopeptidases. This inhibitor also blocked the presentation of MAGE-A3168-176 by tumor cells. Processing of the antigenic peptide was observed in HLA-A1 cells electroporated by the 20-mer precursor or by a precursor modified at the C- and N-terminus to exclude exopeptidase activity. With both precusors, the processing was inhibited by treating cells with o-phenanthroline concluding to a major role of a cytosolic metalloendopeptidase. One such enzyme is insulin-degrading enzyme (IDE). We observed that depletion of IDE abolished the capacity of a cytosolic fraction to produce the antigenic peptide. Furthermore, recombinant IDE was able to produce the peptide in vitro from the 20-mer peptide. Using a siRNA approach we observed that a reduction of IDE expression in tumor cells resulted in a reduced capacity of MAGE-A3168-176 presentation. Lastly, half-life studies revealed that in melanoma cells proteasome and IDE act as parallel ways for the degradation of MAGE-A3 contributing together to a different set of peptides.La majorité des peptides antigéniques reconnus par les lymphocytes T cytolytiques sont produits à partir de la dégradation des protéines cellulaires qui implique principalement le protéasome. Certains peptides antigéniques sont cependant produits par une voie qui ne dépend pas du protéasome. Le peptide antigénique dérivé de la protéine tumorale MAGE-A3 (EVDPIGHLY) et présenté par le HLA-A1 a été utilisé dans de nombreux essais de vaccinations chez des patients souffrant de mélanomes métastatiques. Au cours de ce travail, nous avons observé que ni l’inhibition du protéasome ni celle de la tripeptidyl peptidase II ne compromettait la présentation de l’antigène par des cellules tumorales. La présentation de l’antigène étant dépendante du transporteur TAP, cela indiquait que MAGE-A3/HLA-A1 était produit dans le cytosol. Nous avons caractérisé l’activité produisant le peptide à partir d’un précurseur de 20 acides aminés comprenant la séquence du peptide antigénique. Nous avons observé que seule la fraction cytosolique était capable de produire le peptide antigénique. La fraction cytosolique traitée avec un inhibiteur de métallopeptidases, l’orthophénanthroline, ne produisait plus le peptide antigénique. Ce même inhibiteur diminuait la présentation du peptide antigénique par des cellules tumorales. La présentation de l’antigène dans des cellules HLA-A1+/ MAGE-A3- à partir du précurseur de 20 acides aminés ou d’un autre modifié à ses deux extrémités indiquait que la production de l’antigène dépendait d’une endopeptidase. La caractérisation de la présentation de l’antigène indiquait que l’insulin-degrading enzyme (IDE) était vraisemblablement la peptidase qui produisait le peptide. Nous avons ensuite observé qu’une IDE recombinante était capable de produire le peptide antigénique et qu’une déplétion de l’IDE abolissait la capacité de production du peptide antigénique par la fraction cytosolique. Le rôle de l’IDE dans la production du peptide antigénique a finalement été confirmé en observant une inhibition de la présentation de l’antigène dans des cellules transfectées avec des siRNA spécifiques de l’IDE. Enfin, nous avons étudié la dégradation intracellulaire de MAGE-A3 et observé que l’IDE et le protéasome représentaient deux voies de dégradation parallèles qui ensemble contribueraient à la diversité des peptides.(SBIM 3) -- UCL, 201