Characterization of proteins involved in turnover of glycosomes in Trypanosoma brucei

Sleeping sickness is an infectious disease affecting humans in sub-Saharan Africa. It is caused by the protist Trypanosoma brucei which is transmitted by blood-feeding tsetse flies. This parasite possesses many unique features, including the organisation of the major part of the glycolytic pathway in peroxisome-like organelles known as glycosomes. This compartmentalisation has been shown to be essential for the viability of the parasite. During its life cycle, T. brucei proceeds through several stages. In its mammalian host, the parasite presents itself as a bloodstream form that, for its ATP supply, is dependent on glucose from the host’s blood and in the tsetse fly’s midgut it occurs as the procyclic form. In this latter stage the parasite prefers the less available glucose, but can also feed, for its energy, on amino acids such as proline and glutamine. The enzyme composition of glycosomes from each of these two stages is associated to the parasite’s metabolic needs. Bloodstream trypanosomes have 90% of the glycosomal enzyme content dedicated to glycolysis, while in glycosomes from procyclic cells this number drops to 40-50%, and the parasites develop a more diversified metabolism. Experiments performed in our laboratory have shown an increase in colocalisation of markers for glycosomes and the lysosome during the steps by which trypanosomes differentiate from the bloodstream to the procyclic form. This indicates that autophagy plays a role in the metabolic adaptation of the parasites during differentiation. It has been shown in yeast cells that peroxisomes reach a certain stage where they are no longer able to import matrix proteins from the cytosol. These organelles then, can be considered unable to adapt their enzyme content to changes in carbon source. We propose that a similar situation may happen in T. brucei where mature glycosomes that are rich in glycolytic enzymes and no longer able to import matrix proteins will be specifically degraded when the parasite differentiates into the procyclic form and requires the expression of a new set of glycosomal enzymes. Our project had two objectives: the characterization of proteins that participate in the degradation as well as a protein implicated in the growth of glycosomes, being respectively, autophagy-related proteins (ATGs) involved in the organelle degradation and a peroxin (PEX), involved in the organelle’s biogenesis, more specifically in matrix protein import. Here we present the characterisation of a T. brucei protein whose yeast counterpart participates in specific autophagy, ATG24, also present in mammalian cells where it is known as SNX4. This protein is part of a putative complex that is involved in autophagy induction and the switch between general autophagy and specific autophagy, including pexophagy, mitophagy, the cytoplasm-to-vacuole pathway and piecemeal microautophagy of the nucleus. TbATG24 seems to be required for the maintenance of the lysosomal morphology in bloodstream and procyclic cells and also participates in endocytosis, as shown by the effect of its RNA interference-dependent partial depletion on transferrin import in a bloodstream-form cell line. This latter function is evolutionary conserved, as it is also found for its orthologues in mammalian cells and yeasts. Moreover the interaction of TbATG24 with endosomal membranes has been shown to be dependent on TbVPS34 and to be sensitive to wortmannin treatment, in agreement with observations reported for its yeast counterpart. Interestingly, its downregulation leads to an increase in autophagosome numbers in autophagy-inducing conditions and an increase of the rate of in vitro differentiation of monomorphic T. brucei cells. Another ATG protein characterized in this study is ATG8, the autophagy marker. Using GFP-tagged constructs, we observed that two different isoforms of ATG8, TbATG8.1 and TbATG8.2, both locate to puncta under different autophagy-inducing conditions and therefore can both be considered as autophagosomal markers. Moreover both isoforms of the protein colocalise with the glycosomal marker triosephosphate isomerase during induction of in vitro differentiation, indicating that both are involved in pexophagy for glycosome turnover. Intriguingly, we observed a different rate of differentiation for cells expressing the GFP-tagged ATG8.2 or cells with GFP-ATG8.1. The T. brucei glycosomal matrix-protein import machinery is similar to that described for peroxisomal protein import in yeasts, with some of the proteins conserved. So far about a dozen proteins that participate in glycosome biogenesis and matrix protein import (called peroxins or PEX proteins) have previously been characterised in our laboratory. Among the peroxins characterised is TbPEX13, a transmembrane component of a complex on which dock TbPEX5 and TbPEX7, cytosolic receptors for proteins with a peroxisomal-targeting signal (PTS). In addition to binding the receptors, TbPEX13 interacts also with TbPEX14, another component of the docking complex. TbPEX13 has been shown to be essential for the parasites and to be involved in the import of PTS-containing proteins. Despite its conserved role and some structural features in common with PEX13s from other organisms, this protein also lacks important PEX13 signatures and has other remarkable features. We describe the identification and characterisation of a second TbPEX13, named TbPEX13.2, that also lacks some PEX13 traits, such as a SH3 domain, but in other respects is more similar to the PEX13 of other organisms than the previously found TbPEX13 (now called TbPEX13.1). We show that this second TbPEX13 is associated with glycosomes, where it interacts with PEX13.1 and other peroxins. It is essential for bloodstream-form cells and participates in the import of PTS proteins. Moreover, as seen for TbPEX13.1, this second isoform is also involved in the association of PEX14 to the glycosomal membrane. Trypanosomatids are the first organisms where two distinct isoforms of PEX13 have been described. La maladie du sommeil est une maladie infectieuse qui affecte l’homme en Afrique subsaharienne. Elle est causée par le protiste Trypanosoma brucei qui est transmis par la mouche tsé-tsé lors d’un repas sanguin. Ce parasite possède de nombreuses caractéristiques uniques, y compris l’organisation d’une grande partie de sa voie glycolytique dans des organites de la famille des peroxisomes, appelées glycosomes. Il a été démontré que cette compartimentation est essentielle pour la viabilité du parasite. Au cours de son cycle de vie, T. brucei passe par plusieurs stades. Chez l’hôte mammifère, il est sous la forme sanguicole qui, pour son approvisionnement en ATP, est dépendante du glucose présent dans le sang de l’hôte. Dans l’intestin de la mouche tsé-tsé, il est présent sous la forme procyclique. A ce stade, le parasite préfère le glucose même s’il est peu disponible, mais peut également utiliser, pour produire son énergie, des acides aminés comme la proline et la glutamine. La composition enzymatique des glycosomes dans ces deux stades est liée aux besoins énergétiques du parasite. Dans la forme sanguicole des trypanosomes, 90% du contenu enzymatique est dédié à la glycolyse ; tandis que dans les glycosomes des cellules procycliques, cette proportion tombe à 40-50% et le parasite développe un métabolisme plus diversifié. Des expériences réalisées dans notre laboratoire ont montré une augmentation de la co-localisation des marqueurs des glycosomes et des lysosomes durant les étapes de différenciation de la forme sanguicole à la forme procyclique. Ceci indique que l’autophagie joue un rôle dans l’adaptation métabolique de ces parasites durant la différenciation. Dans les cellules de levure, il a été montré que les peroxysomes atteignent un certain stade au delà duquel ils ne sont plus capables d’importer des protéines matricielles en provenance du cytosol. Ces organites peuvent alors être considérées comme incapables d’adapter leur contenu enzymatique aux changements de source de carbone. Nous proposons qu’une situation similaire pourrait exister chez T. brucei où les glycosomes matures, qui sont riches en enzymes glycolytiques et incapables d’importer des protéines matricielles, seraient dégradés spécifiquement quand le parasite se différencie en forme procyclique et nécessite l’expression d’un nouveau groupe d’enzymes glycosomales. Notre projet avait deux objectifs: la caractérisation de protéines qui participent à la dégradation ainsi qu’une protéine impliquée dans la croissance des glycosomes, soit respectivement les protéines liées à l’autophagie (“autophagy-related proteins” ou ATGs) impliquées dans la dégradation des organites et une peroxine (PEX), impliquée dans la biogenèse des organites et plus particulièrement dans l’importation des protéines matricielles. Nous présentons ici la caractérisation d’une protéine de T. brucei dont l’équivalent chez la levure participe à l’autophagie spécifique, ATG24, également présente dans les cellules mammifères où elle est connue comme la SNX4. Cette protéine fait partie d’un probable complexe impliqué dans l’induction de l’autophagie et le changement entre l’autophagie générale et spécifique, incluant la pexophagie, la mitophagie, la voie cytoplasme-vacuole et la microautophagie du noyau. TbATG24 semble être nécessaire pour le maintien de la morphologie des lysosomes dans les cellules sanguicoles et procycliques et participe également à l’endocytose, comme montré par l’effet de son élimination partielle par interférence à l’ARN sur l’importation de la transferrine dans une lignée cellulaire de cellules sanguicoles. Cette dernière fonction est conservée au cours de l’évolution, comme c’est également le cas pour ses orthologues dans les cellules mammifères et les levures. De plus, il a été montré que l’interaction de TbATG24 avec les membranes des endosomes est dépendante de TbVPS34 et est sensible au traitement par la wortmannin, en accord avec les observations rapportées pour l’équivalent chez la levure. Il est intéressant de noter que cette dérégulation conduit à une augmentation du nombre d’autophagosomes en condition d’induction de l’autophagie et à une augmentation de la vitesse de la différenciation in vitro des celles monomorphiques de T. brucei. Une autre protéine ATG caractérisée dans cette étude est l’ATG8, le marqueur d’autophagie. En utilisant des constructions marquées par la GFP, nous avons observé que les deux isoformes d’ATG8, TbATG8.1 et TbATG8.2, sont localisées de manière ponctuelle sous différentes conditions d’induction de l’autophagie et peuvent dès lors être considérées comme des marqueurs d’autophagosomes. De plus, les deux isoformes de la protéine sont co-localisées avec le marqueur glycosomal, la triosephosphate isomérase, durant l’induction de la différenciation in vitro, indiquant que toutes les deux sont impliquées dans la pexophagie pour le renouvellement des glycosomes. Etonnement, nous avons observé une vitesse de différenciation différente pour les cellules exprimant l’ATG8.2 marquée à la GFP ou pour les cellules avec la GFP-ATG8.1. La machinerie d’importation des protéines matricielles des glycosomes est semblable à celle décrite pour l’importation des protéines peroxisomales chez les levures et certaines protéines sont conservées. Jusqu’à présent, une douzaine de protéines participant à la biogenèse des glycosomes et à l’importation des protéines matricielles (appelées peroxines ou protéines PEX) ont été caractérisées dans notre laboratoire. Parmi ces peroxines caractérisées, TbPEX13, est un composant transmembranaire du complexe sur lequel viennent se fixer TbPEX5 et TbPEX7, deux récepteurs cytosoliques pour les protéines possédant un signal de ciblage vers les peroxisomes (PTS). En plus de lier les récepteurs, TbPEX13 interagit aussi avec TbPEX14, un autre composant du complexe d’amarrage. Il a été montré que TbPEX13 est essentielle pour les parasites et est impliquée dans l’importation des protéines porteuses d’un signal PTS. Malgré son rôle conservé et certaines caractéristiques structurales en commun avec les PEX13 d’autres organismes, cette protéine manque certaines signatures importantes des PEX13 et possède d’autres caractéristiques remarquables. Nous décrivons l’identification et la caractérisation d’une seconde TbPEX13, appelée TbPEX13.2, à qui il manque certains traits des PEX13, comme le domaine SH3, mais qui par d’autres aspects est plus similaire aux PEX13 d’autres organismes que la PEX13 trouvée précédemment (appelée maintenant TbPEX13.1). Nous montrons que cette seconde TbPEX13 est associée aux glycosomes, où elle interagit avec PEX13.1 et d’autres peroxines. Elle est essentielle pour les cellules de la forme sanguicole et participe dans l’importation des protéines avec un PTS. De plus, comme montré pour TbPEX13.1, cette seconde isoforme est aussi impliquée dans l’association de PEX14 avec la membrane glycosomale. Les trypanosomatidés sont les premiers organismes où deux isoformes distinctes de PEX13 ont été décrites.(FARM 3) -- UCL, 201