Estudo da proteína centrina5 de Trypanosoma cruzi

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2020.O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas, zoonose endêmica das Américas do Sul e Central. É um parasito da ordem Kinetoplastidea, família Trypanosomatidae caracterizado pelo DNA mitocondrial cinetoplasto (kDNA). Atualmente estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com T. cruzi no mundo das quais 4,6 milhões no Brasil. As proteínas centrinas foram descritas inicialmente como componentes dos centros organizadores de microtúbulos em eucariotos. São proteínas da família EF-Hand composto por dois pares de hélice-alça-hélice, motivo de ligação ao Ca2+. Ao se ligar ao Ca2+, essas proteínas mudam de conformação conferindo mobilidade ao sistema. Em cinetolplastídeos foram descritas cinco centrinas (CEN1 - CEN5) que se relacionam com a duplicação de organelas e citocinese, sendo que a CEN5 foi identificada apenas nesse grupo de organismos e ainda é muito pouco estudada. A centrina5 em T. cruzi possui a expressão de mRNA relativamente alta em todas as principais fases de vida. Esse trabalho teve como objetivo o estudo da proteína centrina5 de T. cruzi. A partir da sequência de aminoácidos predita para essa proteína, realizamos análises in silico. O estudo das famílias proteicas da TcCEN5 previu dois domínios EF- hand, responsáveis pela ligação ao Ca2+. A modelagem tridimensional da proteína previu uma estrutura com a pontuação de GMQE igual a 0,64. Os estudos filogenéticos relacionaram a TcCEN1 e TcCEN3 à TcCEN5; assim possivelmente, essas proteínas possuem funções análogas. Para o estudo da função, silenciamento gênico foi realizado através do sistema CRISPR/Cas9. Para tal, parasitos modificados de T. cruzi, que expressam a Cas9, foram utilizados em conjunto a RNAs guia (sgRNA) com o objetivo de induzir mutação gênica no gene TcCEN5 introduzindo códons de parada precoce. Os sgRNAs desenvolvidos e utilizados nesse trabalho foram eficientes para gerar o silenciamento gênico, entretanto, não houve detecção de mudança na morfologia do parasito. Estudos posteriores são necessários a fim de estabelecer uma função para essa proteína dentro da fisiologia do T. cruzi.Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas' disease, an endemic zoonosis in South and Central America. It is a parasite of the order Kinetoplastidea, family Trypanosomatidae, characterized by the mitochondrial kinetoplast DNA (kDNA). Currently it is estimated that 8 million people are infected with T. cruzi in the world, 4.6 million of these patients, in Brazil. Centrin proteins were initially described as components of microtubule organizing centers in eukaryotes. They are proteins of the EF-Hand family composed of two pairs of helix-loop-helix, reason for binding to Ca2+. When binding to Ca2+, these proteins change conformation giving mobility to the system. In kinetoplastids, five centrins (CEN1 - CEN5) have been described. They are related to the duplication of organelles and cytokinesis. CEN5 has been identified only in this group of organisms and is still very poorly studied. Centrin 5 in T. cruzi has relatively high mRNA expression in all main life stages. This work aimed to study the T. cruzi centrin5 protein. From the aminoacid sequence predicted for this protein, we perform in silico analyses. The study of the protein families of TcCEN5 predicted two EF-hand domains, responsible for binding to Ca2+. The three-dimensional modeling of the protein predicted a structure with a GMQE score of 0.64. Phylogenetic studies related TcCEN1 and TcCEN3 to TcCEN5; possibly, these proteins have analogous functions. For the study of function, gene silencing was performed using the CRISPR-Cas9 system. For this purpose, modified T. cruzi parasites, which express Cas9, were used together with guide RNAs (sgRNA) in order to induce gene mutations in the TcCEN5 gene by introducing early stop codons. The sgRNAs developed and used in this work were efficient to generate gene silencing, however, there was no detection of variation in the parasite's morphology. Further studies are needed in order to establish a function for this protein within the physiology of T. cruzi