Potencial nematotóxico de extratos vegetais obtidos a partir de acessos de uma espécie de Solanaceae para o controle de Meloidogyne incognita

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2019.Os nematoides pertencentes ao filo Nematoda, apresentam um plano corporal simples, e estão entre os grupos de animais mais abundantes da terra. Os nematoides das galhas radiculares (Meloidogyne spp.) são considerados um dos principais responsáveis por grandes impactos na produção agrícola mundial, afetando severamente diversas culturas de interesse econômico. Esses nematoides promovem alterações no sistema radicular das hospedeiras impedindo a absorção adequada dos nutrientes, sendo a espécie M. incognita a de maior destaque devido à sua alta polifagia. Algumas estratégias são adotadas como medidas de controle deste fitopatógeno, sendo o uso de nematicidas sintéticos o método mais explorado, apesar de serem nocivos ao meio ambiente e à saúde humana. Nesse cenário, surge uma demanda na busca de novos produtos nematotóxicos eficazes e ambientalmente seguros, com substâncias inovadoras que possuam ampla diversidade estrutural, como os compostos ou metabólitos de composição química diversa, oriundos de plantas. A família Solanacea é considerada uma das maiores famílias de angiospermas com ampla distribuição mundial, sendo fonte abundante de metabólitos secundários bioativos, com relatos na literatura de diversas aplicações para o controle de fitopatógenos na agricultura. Neste contexto, os objetivos deste estudo foram avaliar a reação de quatro acessos de plantas de uma espécie da família Solanaceae ao nematoide M. incognita; avaliar a atividade nematotóxica (nematostática e/ou nematicida) de extratos cru aquosos (ECAs) de sementes e raízes desses acessos sobre a fase infectante (J2) de Meloidogyne spp; identificar o ECA e a fração cromatográfica mais efetiva para o controle de M. incognita. Adicionalmente buscou-se também aferir a termoestabilidade dos ECAs com atividade nematotóxica, e a reação desses acessos à infecção por M. incognita por meio da quantificação da população total (ovos e J2) presentes nas raízes (NOJ2), número total de galhas (NG), número total de massas de ovos (NMO), quantidade de ovos e J2 por grama de raiz (NOJ2/GR), e o fator de reprodução (FR), inferindo-se a reação de resistência, suscetibilidade ou imunidade. Também foram aferidas a citotóxicidade sobre hemácias bovinas, células do ovário de Spodoptera frugiperda, e queratinócitos humanos (HaCat); fitotoxicidade sobre a germinação de soja; capacidade de inibição de organismos não-alvo, como bactéria (Bradyrhizobium japonicum), fungos (Trichoderma asperellum e T. harzianum) e levedura (Candida maltosa) presentes no solo. Os ECAs provenientes de sementes dos acessos 48, 52 e 78 apresentaram atividade nematicida significativa na concentração de 1000 μg.ml-1 , com mais de 90% dos juvenis de segundo estádio (J2) de Meloidogyne spp. mortos, após o bioensaio in vitro de recuperação. Os ECAs de sementes dos acessos (48, 52 e 78) nessa concentração, também foram termoestáveis, e aferiu-se a reação de resistência para os acessos 48 e 52, sendo o acesso 78 considerado suscetível nesse estudo. Adicionalmente, os ECAs de sementes dos acessos (48, 52 e 78) apresentaram baixa citotoxicidade para hemácias bovinas e células do ovário de S. frugiperda. A viabilidade celular de queratinócitos humanos (HaCat) tratados com esses ECAs foi superior a 50%, e nessa concentração não foram fitotóxicos para a germinação de soja (Glycine max), na qual as plântulas resultantes de sementes tratadas com esses extratos, apresentaram crescimento e peso seco e fresco superiores aos do controle. Adicionalmente os ECAs de sementes desses acessos não inibiram o crescimento de fungos, bactérias e leveduras benéficos do solo. O ECA ativo de sementes do acesso 48 foi o de maior destaque dentre os tratamentos, com atividade nematicida de 100 % para a concentração de 1000 μg.ml-1 , sendo a DL50 de 108.2 μg.ml-1 . Esse ECA foi selecionado, e fracionado via cromatografia líquida de alta performance com coluna de exclusão molecular (HPLC-ME). Onze frações foram geradas, e avaliadas sobre M. incognita, sendo a fração 6 (Fr6) a mais efetiva quanto sua ação nematicida. Esta fração (Fr 6) foi selecionada para purificação via cromatografia líquida de alta performance com coluna de adsorção por fase reversa (HPLC-RP), e resultaram em outras 17 frações, onde as massas das frações obtidas a partir de HPLC-ME e HPLC RP, foram mensuradas por MALDI-TOF. Os dados gerados neste trabalho evidenciaram a potencialidade nematicida do ECA das sementes dos acessos 48, 52 e 78 de uma espécie de planta pertencente à família Solanaceae, além de atestar a especificidade da ação para J2 de M. incognita, um dos fitonematoides mais importantes para a agricultura no Brasil e no mundo.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Nematodes belonging to the phylum Nematoda present a simple body plane and are among the most abundant animal groups on Earth. Root-knot nematodes (RKNs) (Meloidogyne spp.) are responsible for pronounced losses on global agricultural production, causing severe damage on a wide range of economically relevant crop species. Infection by RKNs alters the morphology of the host plant root system, preventing adequate water and nutrient absorption. Meloidogyne incognita is considered of high relevance due to its proeminent polyphagy. Among the several strategies to control this plant pathogen, application of synthetic chemicals with nematicidal activity is by far the most used, regardless of the environmental and human health risks. In view of this scenario, there is a pressing need to develop alternative, efficient and environmentally safe products, composed by novel substances with high structural diversity, as the ones prospected in plants containing a high abundance of diverse chemical compounds. The Solanaceae botanical family is composed by a large number of species with wide geographic distribution, representing an abundant source of bioactive secondary metabolites for the control of important plant pathogens that infect crop species. In this context, the present study aimed to evaluate the reaction of four different Solanaceae plant accessions to the nematode M. incognita, to certify the nematotoxic (nematostatic and/or nematicidal) activity of aqueous crude extracts (ACEs) obtained from seeds and roots of solanaceous accessions on the infecting phase (J2) of Meloidogyne spp. and to identify the ACE and the chromatographic fraction most effective in controlling M. incognita. Moreover, it also intended to evaluate thermostability of the ACEs with nematotoxic activity in previous test; and the host reaction (resistance, susceptibility, immunity) to infection by M. incognita of accessions from which the ACEs were originated, through quantification of total population (eggs and J2) present in the root system (NOJ2), total number of galls (NG), total number of egg masses (NMO), numbers of eggs and J2 per gram of roots (NOJ2/GR), and the reproduction factor (FR). This study also evaluated the ECAs toxicity over bovine red blood cells; ovary cells of Spodoptera frugiperda, and human keratinocytes (HaCat); the phytotoxicity over soybean germination; the inhibition capacity on non-target soil organisms, such as bacterium (Bradyrhizobium japonicum), fungi (Trichoderma asperellum and T. harzianum) and yeast (Candida maltosa). The seed ACEs from the accessions 48, 52 and 78 exhibited a significant nematicidal activity at the concentration of 1000 μg.ml-1 , causing mortality of more than 90% of J2 Meloidogyne spp. after the in vitro recovery bioassay. The seed ACEs from the accessions 48, 52 and 78 at 1000 μg.ml-1 concentration, were found to be thermostable. The resistance reaction was confirmed for the accessions 48 and 52, and the accession 78 being considered susceptible in this study. Additionally, the seed ACEs from the accessions 48, 52 and 78 presented low cytotoxicity for both, bovine red blood cells and Spodoptera frugiperda ovary cells. The cellular viability of human keratocytes (HaCat) treated with these ACEs was superior to 50%. At this concentration, these extracts were not phytotoxic to soybean (Glycine max) seed germination, instead the seedlings originated from the treated seeds reacted with higher growth rate, fresh plant weight and dry plant weight, in comparison to seedlings originated from the control treatment. Also, these ACEs were not able to inhibit the growth and development of the fungi, bacterium and yeast used as model organisms, with no changes in relation to the control treatment. The bioactive seed ACE from the accession 48 presented 100% nematicidal activity at 1000 μg.ml-1 concentration, and LD50 of 108.2 μg. Due to these results, this ACE was fractionated via Molecular Exclusion High Performance Liquid Chromatography (HPLC-ME), generating 11 fractions, that were evaluated on M. incognita. The fraction 6 (Fr6) demonstrated the highest nematicidal activity and was selected for further purification via Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (HPLC-RP) with the generation of another 17 fractions. The molecular mass of the fractions obtained via HPLC-ME and HPLC-RP were measured via MALDI-TOF. The data generated in this study revealed the nematicidal potential of seed ACEs from the accessions 48, 52 and 78, which belong to a plant species from the botanical Family Solanaceae. Furthermore, these data confirm the specificity of the action toward J2 of M. incognita, one of the most relevant plant pathogens to agricultural systems worldwide