O peptídeo TOAP-2 interfere com a atividade pró-inflamatória de LPS em fagócitos murinos

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2020.O aumento no número de casos de aquisição de resistência de fungos e bactérias contra fármacos atuais, em associação com a diminuição no número de medicamentos aprovados que apresentem novos mecanismos de ação, vem estimulando a procura por tratamentos alternativos para doenças infecciosas. Os avanços tecnológicos na síntese de peptídeos, reduzindo os seus custos, renovaram o interesse da indústria farmacêutica sobre essas moléculas. Peptídeos antimicrobianos (AMP) são pequenas moléculas evolutivamente conservadas, presentes no sistema imune de todos os grupos de organismos, com atividade microbicida e imunomodulatória. Acredita-se que a regulação das respostas inflamatórias seja a principal função dessas moléculas em organismos vertebrados. Neste trabalho, foram avaliadas as propriedades imunomodulatórias de ToAP-2, um AMP catiônico sem pontes dissulfeto derivado da peçonha do escorpião Tityus obscurus, sobre macrófagos tipo M1 (BMM) e células dendríticas (BMDC) derivados da medula óssea de camundongos C57BL/6. Os ensaios realizados mostraram que ToAP-2 não alterou a fagocitose de leveduras de Cryptococcus neoformans por BMMs e BMDCs após 30 min ou 2 h de infecção. Da mesma maneira, ToAP-2 também não afetou a atividade fungicida de BMMs, determinada em ensaios de contagem de unidades formadoras de colônia. Também analisamos a secreção de MCP-1, IL-6 e TNF-α no sobrenadante de BMMs e BMDCs estimulados com apenas ToAP-2, ou com o peptídeo e o lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli por 6 h ou 24 h. ToAP-2 reduziu significativamente a secreção dessas citocinas, indicando uma possível interação, direta ou indiretamente, com LPS. Para investigar essa hipótese, células de E. coli e C. neoformans foram expostas à suas respectivas concentrações inibitórias mínimas de ToAP-2 na presença de diferentes concentrações de LPS em diluição seriada variando de 100 a 0,78 μg/mL. Observamos que ToAP-2 perdeu sua atividade antifúngica e antimicrobiana na presença de LPS (a 100 e 12.5 μg/mL, respectivamente), corroborando a hipótese de que ToAP-2 possa interagir diretamente com LPS.CNPq, FAP-DF e a CAPESThe rise in antimicrobial resistance by fungi and bacteria against current drugs, as well as the diminishing numbers of drugs with novel mechanisms being approved, has encouraged the search for alternative treatment options. The technological improvements on peptide synthesis reduced its costs and renewed the interest of pharmaceutical companies in these molecules. Antimicrobial peptides (AMP) are evolutionary conserved molecules in the immune system of all groups of organisms with both antimicrobial and immunomodulatory activities. It is thought that the primary role of AMPs in vertebrates is the regulation of inflammation. In this study, we evaluated the immunomodulatory properties of ToAP-2, a cationic non-disulfide-bridged peptide derived from the scorpion Tityus obscurus’ venom, on bone marrow derived M1-like macrophages/dendritic cells (BMM/BMDC) from C57BL/6 mice. The experiments revealed that ToAP-2 had no effect on the phagocytosis of the yeast Cryptococcus neoformans by neither BMM or BMDC after 30 min or 2 h of infection. Similarly, ToAP-2 had no effect on yeast killing by BMM, as determined by colony formation units experiments. We also evaluated the production of MCP- 1, IL-6 and TNF-α by BMMs or BMDCs after stimulation with ToAP-2 alone, or in combination with Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) for 6 h or 24 h. ToAP-2 significantly reduced these cytokine levels, suggesting a possible direct or indirect interaction with LPS. To address this hypothesis, we performed experiments where E. coli and C. neoformans were exposed to their respective minimum inhibitory concentration of ToAP-2 in presence of different concentrations of LPS (100 to 0,78 μg/mL). We observed that ToAP-2 lost its antifungal and antibacterial properties in the presence of LPS concentrations of 100 and 12,5 μg/mL, respectively. These results corroborate a possible physical interaction between both molecules