Produção de 2'-fucosil-lactose em Kluyveromyces lactis utilizando manose como fonte de carbono

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2020.Os oligossacarídeos do leite humano (HMOs) possuem papel fundamental no desenvolvimento de recém-nascidos os protegendo contra toxinas e patógenos. O HMO encontrado em maior abundância é a 2'-fucosil-lactose (2'FL), sendo também o açúcar mais estudado e utilizado para suplementação de fórmulas neonatais. A sua via de síntese de novo utiliza como molécula precursora a manose, um epímero C2 da glicose. A forma polimérica desse açúcar, a manana, está presente em diversas biomassas vegetais como a semente de açaí, principal resíduo da produção de polpa de açaí. A hidrólise das sementes de açaí realizada pelo INT, recuperou mais de 90% dos açúcares presentes na semente em suas frações monoméricas fermentáveis, principalmente manose. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi utilizar manose como fonte de carbono disponível a fim de estabelecer uma nova rota tecnológica para produção de 2'FL. A levedura que mostrou maior velocidade específica de crescimento em hidrolisado (0.0468 h-1) e a menor diferença cinética entre a utilização de glicose e manose foi a levedura Kluyveromyces lactis. Ademais, crescimentos em frascos mostraram pouca diferença cinética entre crescimento em manose (0.324 h-1) e glicose (0.348 h-1) nessa espécie. Esses resultados associados a características fisiológicas da espécie como o crescimento em lactose, uma das moléculas necessárias para síntese da 2'FL, tornam K. lactis um organismo promissor para o processo visado. Dessa forma, três cassetes de expressão gênica foram construídos para possibilitar a conversão da manose em 2'FL. Os genes gmd e fcl de Escherichia coli, cujas expressões possibilitam a síntese de GDP-fucose, foram inseridos em cassetes de expressão e clonados no plasmídeo pKLAC2. Adicionalmente, foi inserido ao vetor o gene da fucosiltransferase WcfB de Bacteroides fragilis otimizado para expressão em K. lactis que permite a conversão de GDP-Fucose em 2'FL. A cepa GG799 de K. lactis foi então transformada com os plasmídeos pFUC e p2WF e colônias selecionadas por crescimento em acetamida. Clones foram verificados em relação à presença dos genes no genoma da levedura. No entanto, análises preliminares de HPLC não detectaram 2’FL em meio contendo lactose.Human milk oligosaccharides (HMOs) play an essential role in neonatal development, as they stimulate bifidobacterial growth and protect newborns from toxins and pathogens. 2'- fucosyllactose (2'FL) is the predominant and most studied HMO in human milk and therefore, it's used as a supplement for infant formula. The de novo biosynthesis pathway of 2'FL utilizes mannose, a C2 epimer of glucose, as a precursor. Mannan is a polymeric version of this sugar and is present in many agriculture feedstocks such as the açaí seed, the main byproduct in the fruit's pulp processing. The açaí seed's hydrolysis conducted by INT was successful to recover more than 90% of the sugars present in the seed in their monomeric form, predominantly mannose. For that reason, the main goal of this study was to utilize mannose as a substrate in order to establish a new technological route for 2'FL production. The yeast Kluyveromyces lactis presented the highest specific growth rate in the seed hydrolysate (0.0468 h-1) and the least kinetic difference between the use of glucose and mannose as substrate. Furthermore, shake flask cultivations of this species exhibited a similiar kinetic between growth in mannose (0.324 h-1) and glucose (0.348 h-1). These results combined with well-established molecular editing tools and differential traits from K. lactis physiology such as the ability to consume lactose, a component of 2'FL, indicates that this species is a strong candidate for 2'FL production. Therefore, three expression cassettes were constructed to enable the conversion of mannose into 2'FL. The expression of the genes gmd and fcl from Escherichia coli allows GDP-fucose synthesis and consequently, these genes were introduced into expression cassettes and then inserted into pKLAC2 plasmid. Additionally, it was also inserted the gene for WcfB fucosyltransferase from Bacteroides fragilis, optimized for K. lactis expression, which permits GDP-fucose conversion into 2'FL. The K. lactis strain GG799 was transformed with the assembled plasmids pFUC and p2WF and colonies were selected by growth in acetamide. As a result, clones were verified for the presence of the genes gmd and fcl integrated into their genomes. However, preliminary HPLC analysis did not identify 2'FL in culture medium containing lactose