Expressão heteróloga da glicoproteína do vírus da raiva por meio de vírus recombinantes

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2020.A raiva é uma das zoonoses virais mais letais do mundo, provocando cerca de 59.000 mortes humanas todos os anos. O vírus da raiva, pertencente à família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus, possui um RNA senso negativo. É transmitido principalmente por quirópteros e carnívoros, por meio do contato da saliva dos animais infectados com feridas na pele ou mucosas. Após o período de incubação, o vírus leva a um quadro de encefalite aguda, resultando em morte em 99% dos casos. A principal forma de combate à doença adotada pela Organização Mundial da Saúde tem sido a vacinação, em especial, a de animais domésticos. Dentre as formas de prevenção da doença, a vacina oral recombinante tem sido considerada uma proposta interessante, visto que permite a vacinação de animais silvestres na forma de dispersão de iscas. É também uma alternativa mais favorável no mercado de animais de estimação, além de não apresentar riscos quanto à patogenicidade residual. Não havendo um produto nacional para esse fim, procurou-se produzir, neste trabalho, a glicoproteína G do vírus da raiva, que reveste o capsídeo do vírion, para ser utilizada como antígeno na produção de vacinas orais recombinantes. Para tanto, utilizamos células de mamífero como plataforma de expressão, dado o padrão de glicosilação complexo do antígeno. Foram testados dois carreadores virais, um adenovírus e um lentivírus, visando a expressão transiente da proteína e também o desenvolvimento de linhagens produtoras estáveis. O lentivírus, baseado no vírus da imunodeficiência humana tipo 1, apresenta o gene da glicoproteína clonado sob controle do promotor CMV. Adicionalmente, foi feita uma outra construção via overlap extension PCR a fim de produzir a glicoproteína fusionada a um domínio de ligação à celulose, visando facilitar a formulação de iscas baseadas nesse polímero. A produção de partículas virais foi realizada na linhagem 293FT, com posterior quantificação destas e transdução da linhagem 293A para verificar a produção da glicoproteína, com análise do sobrenadante e do conteúdo intracelular por SDSPAGE e western blotting 72h após a infecção. Foram identificadas uma ou mais proteínas na faixa de 65 kDa, que corresponderam ao tamanho esperado para a glicoproteína, que pôde ser identificada também no western blotting. Contudo, bandas semelhantes apareceram nos controles negativos, sendo necessária a otimização do protocolo. Já o adenovírus, baseado no sorotipo 5 humano, disponível em um vetor comercial, teria parte da região E3 substituída pelo cassete da glicoproteína G através da técnica de recombineering, utilizando o gene que confere resistência a espectinomicina 17 como marca de seleção. Com a confirmação da correta inserção e posterior remoção da marca pelo sistema Cre-Lox, o sistema seria induzido em células de mamífero, com a produção de partículas virais infectantes e a confirmação da produção da proteína feita por western blotting. No entanto, não foi possível obter clones através da técnica de recombineering, considerada a mais adequada para clonagem em uma região desfavorável, fazendo-se necessária a formulação de uma nova estratégia. O trabalho foi pioneiro na expressão heteróloga associada a carreadores virais dentro do grupo de pesquisa, podendo ser utilizado como referência para otimização em projetos futuros.CNPqRabies is one of the most lethal viral zoonoses in the world, leading to about 59,000 human deaths each year. The rabies virus, which belongs to the family Rhabdoviridae, genus Lyssavirus, has a negative sense RNA. It is transmitted mainly by chiropterans and carnivores, through the contact of saliva of infected animals with skin or mucosal wounds. After the incubation period, the virus leads to acute encephalitis, resulting in death in 99% of cases. The main way of fighting the disease adopted by the World Health Organization has been vaccination, especially that of domestic animals. Among the forms of disease prevention, the recombinant oral vaccine has been considered an interesting proposal, since it allows the vaccination of wild animals in the form of bait dispersion. It is also a more favorable alternative in the pet market, in addition to presenting no risks regarding residual pathogenicity. In the absence of a national product for this purpose, the aim was to produce, in this work, the glycoprotein G of the rabies virus, which covers the capsid of the virion, to be used as an antigen in the production of oral recombinant vaccines. For that, we used mammalian cells as an expression platform, given the complex glycosylation pattern of the antigen. Two viral vectors, an adenovirus and a lentivirus, were tested, aiming at the transient expression of the protein and also the development of stable producing strains. The lentivirus, based on the human immunodeficiency virus type 1, presents the cloned glycoprotein gene under the control of the CMV promoter. Additionally, another construction was made via overlap extension PCR in order to produce the glycoprotein fused to a cellulose binding domain, aiming to facilitate the formulation of baits based on this polymer. The production of viral particles was performed in the 293FT cell line, with subsequent quantification and transduction of the 293A cell line to verify the glycoprotein production, with analysis of the supernatant and intracellular content by SDS-PAGE and western blotting 72h after infection. One or more proteins were identified in the 65 kDa range, which corresponded to the expected size for the glycoprotein, which could also be identified in western blotting. However, similar bands appeared in the negative controls, making it necessary to optimize the protocol. The adenovirus, based on human serotype 5, available in a commercial vector, would have part of the E3 region replaced by the glycoprotein G cassette through the recombineering technique, using the gene that confers resistance to spectinomycin as a selection mark. With the confirmation of the correct insertion and subsequent removal 19 of the mark by the Cre-Lox system, the construct would be induced in mammalian cells, with the production of infectious viral particles and the confirmation of the production of the protein made by western blotting. However, it was not possible to obtain clones using the recombineering technique, considered the most suitable for cloning in an unfavorable region, making it necessary to formulate a new strategy. The work was a pioneer in heterologous expression associated with viral vectors within the research group, and can be used as a reference for optimization in future projects