Untersuchungen zur Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies bei der Schädigung der Haarzellen des Innenohres durch das Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin und Zytostatikum Cisplatin

Um in vitro Einflussfaktoren der Innenohrschädigungen durch H2O2, Cisplatin und Gentamicin genauer erforschen zu können, wurde zunächst das in vitro-Modell des unfixierten neurosensorischen Epithels der Meerschweinchencochlea etabliert. Da die Vitalität der verschiedenen Zellen des Epithels in gepufferter Salzlösung (HBSS) mindestens 6 h erhalten blieb, wurden alle Untersuchungen innerhalb dieser Zeitspanne durchgeführt. Die empfindlichsten Zellen gegenüber allen eingesetzten Substanzen waren die äußeren Haarzellen, gefolgt von den inneren Haarzellen. Stützzellen (Hensen-Zellen und Deiters-Zellen) wurden nicht durch H2O2, Cisplatin oder Gentamicin geschädigt. Dieses Schädigungsmuster entspricht dem in vivo beobachteten Schädigungsverlauf nach Injektion von Cisplatin oder Gentamicin und auch nach traumatischen Lärm. Aus Versuchen mit H2O2 ging hervor, dass diese Sauerstoffspezies Haarzellen dosisunabhängig (200 µM oder 50 µM) sowohl kalzium- als auch eisenabhängig schädigt. Auch Antioxidantien wie Glutathion oder N-Acetylcystein spielen bei der Schädigung durch H2O2 (200 µM) eine wichtige Rolle. Die morphologischen Veränderungen der Haarzellen in Gegenwart der hohen H2O2-Konzentration deuteten auf einen nekrotischen, die in Gegenwart der niedrigeren Konzentration hingegen auf einen apoptotischen Zelltod hin. Das heißt, dass beide H2O2-induzierten Schädigungstypen sowohl durch Kalzium- als auch durch Eisenionen vermittelt werden. Auch die Schädigung der äußeren Haarzellen durch Cisplatin war teilweise eisen- und teilweise kalziumabhängig. Die Rolle des zellulären chelatisierbaren Eisenpools wurde mit dem Fluoreszenzindikator Phen Green SK durch Laser Scanning-Mikroskopie genauer charakterisiert. Es zeigte sich, dass die Eisenchelatoren 2,2´-Dipyridyl und Deferoxamin den Phen Green SK-detektierbaren chelatisierbaren Eisenpool der Zellen komplexieren konnten. Dabei war das lipophile 2,2´-Dipyridyl deutlich effektiver als das hydrophile Deferoxamin, was sich auch in den Befunden der Vitalitätstests widerspiegelte. Die mittels quantitativer Laser Scanning-Mikroskopie bestimmten Konzentrationen des cytosolischen chelatisierbaren Eisens variierten in den verschiedenen Zelltypen nur geringfügig (zwischen 1,3 ± 0,4 µM Eisen in den inneren Haarzellen und 3,7 ± 1,7 µM Eisen in den Hensen-Zellen) und können die unterschiedliche Empfindlichkeit der Zelltypen für H2O2, Cisplatin und auch Gentamicin nicht erklären. Die Zugabe von Cisplatin zu neurosensorischen Epithelien bewirkte keine Veränderung des Phen Green SK-detektierbaren chelatisierbaren Eisenpools aller vier Zelltypen. Durch eine Reduktion von Nitrotetrazoliumblauchlorid konnte jedoch, besonders in den Haarzellen, eine Erhöhung der Superoxidradikal-Anionen-Produktion in Gegenwart von Cisplatin gezeigt werden. Die cisplatininduzierte Schädigung der Haarzellen wird demnach durch eine erhöhte Produktion der Superoxidradikal-Anionen hervorgerufen, die dann teilweise eisen- und kalziumabhängig ohne detektierbare Veränderung des chelatisierbaren Eisenpools der Zellen verläuft. Die morphologischen Veränderungen der Zellen sprechen dafür, dass 50 µM Cisplatin eine Nekrose der Haarzellen auslöst. Gentamicin verursachte eine konzentrationsabhängige Schädigung der Haarzellen des neurosensorischen Epithels, die bei niedrigeren Konzentrationen (0,5 mM und 1mM) eine eisenunabhängige Kondensation des Chromatins der Haarzellen zeigte. Dieser Hinweis sowie die Beobachtung von Blebs oberhalb der Apikalplatten der Haarzellen deuten auf einen apoptotischen Zelltod hin. Ähnlich der Schädigung durch Cisplatin konnte auch die durch Gentamicin verursachte Haarzellschädigung durch Eisenchelatoren teilweise gehemmt werden, während Kalziumionen keinen Einfluss auf die Toxizität hatten. Trotz einer teilweise eisenabhängigen Schädigung der Haarzellen durch Gentamicin konnte weder eine Veränderung des chelatisierbaren Eisenpools der Zellen des neurosensorischen Epithels noch eine Erhöhung der Superoxidradikal-Anionen-Produktion detektiert werden. Bereits 1 Stunde vor Eintritt des Todes der äußeren Haarzellen kam es aber zu einem Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials und Cyclosporin A, ein Inhibitor der mitochondrialen Permeabilitätspore, konnte vor dem durch Gentamicin verursachten Vitalitätsverlust der äußeren Haarzellen teilweise schützen. Zusammengefasst sind dies deutliche Hinweise dafür, dass Gentamicin eine Apoptose auslöst, bei der ein mitochondrialer Permeabilitätsübergang stattfindet. Trotz der zahlreichen parallelen Vorbefunde der Literatur beruht die Toxizität von Gentamicin auf einem anderen Mechanismus als die von Cisplatin. Gentamicin scheint in den äußeren Haarzellen des neurosensorischen Epithels der Meerschweinchencochlea ausschließlich eisenabhängig eine Apoptose auszulösen, in deren Verlauf ein mitochondrialer Permeabilitätsübergang stattfindet. Cisplatin hingegen löst bei vergleichbarer Toxizität in den äußeren Haarzellen Nekrose aus, die durch eine erhöhte Produktion von Superoxidradikal-Anionen verursacht wird und sowohl eisen- als auch kalziumabhängig ist. Teilweise eisen- und kalziumabhängig ist auch die Toxizität von H2O2, unabhängig davon, ob höhere Konzentrationen eine Nekrose oder niedrigere eine Apoptose verursachen. Die ermittelten Konzentrationen des chelatisierbaren Eisens der verschiedenen Zelltypen des neurosensorischen Epithels korrelierten nicht mit der Empfindlichkeit der Zellen gegenüber H2O2, Cisplatin und Gentamicin und lieferten somit keine Erklärung für die höhere Empfindlichkeit der Haarzellen