Untersuchungen zur Beteiligung von Proteasen an der kälteinduzierten Apoptose von Rattenleberendothelzellen

Die moderne Lebertransplantation wäre ohne die Verwendung von Hypothermie (4°C) und Konservierungslösungen nicht möglich. Trotz der Fortschritte der Lebertrans-plantation in den letzten Jahren kommt es auch heute noch zur Konservierungsschädigung der Leber; von dieser sind vor allem die Leberendothelzellen betroffen. Der Schädigungsfaktor Kälte/Wiedererwärmung führt in kultivierten sinusoidalen Leberendothelzellen über einen Anstieg des chelatisierbaren Eisenpools mit konsekutiver Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies zur kälteinduzierten Apoptose. Ob und, falls ja, welche Proteasen an diesem Prozess beteiligt sind, war Gegenstand der vorliegenden Arbeit. In kultivierten konfluenten Rattenleberendothelzellen wurden zunächst verschiedene Proteaseinhibitoren eingesetzt und ihr Effekt auf die Vitalität und Morphologie der Zellen nach Kaltinkubation beurteilt. Hierbei wurde ein sehr guter Schutzeffekt durch den Serin- (und Cystein-) Proteaseinhibitor 3,4-Dichloroisocumarin (DCI) beobachtet. In der Folge wurden die einzelnen Proteaseaktivitäten, insbesondere Serin- und Cysteinproteaseaktivitäten, fluorimetrisch bestimmt. Es ließ sich jedoch keine erhöhte Aktivität von Calpainen, Caspasen, Cathepsin B oder auch Aspartatproteasen nachweisen. Stattdessen konnte eine erhöhte Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC und eine Suc-Ala-Ala-Ala-AMC spaltende Aktivität nachgewiesen werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass es sich bei diesen beiden (erhöhten) Aktivitäten um zwei unterschiedliche Proteasen handelt. Die Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC spaltende Aktivität, wahrscheinlich für den Zelltod bedeutsamer, ließ sich durch DCI und die Proteasominhibitoren Lactacystin und MG-132 signifikant inhibieren. Sie wies einen Km-Wert von ca. 25 µM für Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC und einen Ki-Wert von ca. 25 nM für MG-132 auf und konnte über Immunopräzipitation mit einem Antiproteasomantikörper als Chymotrypsin-ähnliche Aktivität des Proteasoms identifiziert werden. Bei der anderen Protease handelt es sich um eine Serinprotease von bisher unbekannter Art und Bedeutung. Die Aktivierung beider Proteasen (nicht jedoch ihre Aktivität) erwies sich als eisenabhängig. Die Hemmung des Proteasoms (und seiner eisenabhängigen Aktivierung) kann die Schädigung der Leberendothelzellen deutlich reduzieren. Der Einsatz von Eisenchelatoren und/oder Proteasominhibitoren in den Konservierungslösungen während der Kaltlagerung der Leber könnte also über eine Verminderung von Endothelzellschädigung und Mikrozirkulationsstörungen zur Verbesserung der Konservierung führen und das unmittelbare Transplantatversagen reduzieren