Enzymhemmung durch Copolymere aus aminosäurespezifischen Monomeren

Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue spezifische Haftmonomere entwickelt und synthetisiert, eine neue Polymerisationstechnik hat den Zugang zu kleinen Polymer-Bibliotheken eröffnet und ein Screeningverfahren erlaubte es, diese Bibliothek gegen diverse Verdauungsenzyme zu testen. Zur Bindung bisher nicht erkannter Aminosäure-Klassen wurden bekannte Bindungsmotive für saure und aromatische Aminosäuren sowie für Histidin übernommen und als polymerisierbare Monomere hergestellt. Zusätzlich wurden substratmimetische Monomere zur Bindung in der Substratbindungstasche der Enzyme hergestellt. Die Rezeptoren für die sauren Aminosäuren Aspartat / Glutamat und Histidin sowie die aromatischen Aminosäuren waren bereits literaturbekannt und wurden durch die Verknüpfung mit einem Methacrylsäurerest polymerisierbar gemacht. Die substratmimetischen Monomere aus Alanin, Lysin und Phenylalanin wurden durch N-terminale Kupplung mit Methacrylsäurechlorid dargestellt, das Stearinsäure-Monomer 11 durch Kupplung von Stearinsäurechlorid mit dem Ammonium- Monomer 10. Eine neue Polymerisationstechnik wurde entwickelt, die den Anforderungen zur Herstellung einer kleinen Polymer-Bibliothek gerecht wurde. Die Polymerisationen konnten in kleinem Maßstab mit 30 – 50 mg Monomergesamtmenge durchgeführt werden, was nur noch 1/10 der in den Vorarbeiten benötigten Mengen entspricht. In 1 mL - Glasgefäßen konnten bis zu 24 Polymerisationen parallel zueinander im Thermomixer durchgeführt werden. Die Reaktionsgemische wurden nach siebentägiger Reaktionszeit bei 60°C ohne weitere Aufarbeitung getrocknet. Die Ausbeuten waren quantitativ. NMR-spektroskopische Analysen zeigten, dass maximal 10 % Monomerrückstände in den Polymerproben vorlagen, GPC-Analysen ließen auf Molekulargewichte zwischen 50 und 200 kDa schließen. Löslichkeitsprobleme traten bei CBS-haltigen Polymeren auf; die Zugabe von zehn und mehr Äquivalenten des Glucose-Monomers 2 oder ein bis drei Äquivalenten des Ammonium-Monomers 10 erhöhten die Wasserlöslichkeit und ließen Analysen und den Einsatz in enzymatischen Untersuchungen zu. Die Polymere wurden mit fünf Verdauungsenzymen (Chymotrypsin, Trypsin, Cathepsin D, Pankreaslipase und Thrombin) in einem Screeningverfahren untersucht. Sie wurden etwa in 20fachem Überschuss zu den zu untersuchenden Enzymen zugegeben. Das Chymotrypsin konnte durch keines der hergestellten Polymere inhibiert werden. Trypsin wird stark von Polymer 3 inhibiert, das mit fünf Äquivalenten BP die vielen positiven Aminosäuren auf der Oberfläche binden kann. Auch Polymere mit hohem BP- und Phe-Anteil zeigen inhibitorische Effekte auf das Trypsin. Die Inhibierungen erfolgen mit substöchiometrischen Mengen der Polymere. Viele BP-haltige Polymere können die Enzymaktivität von Cathepsin D hemmen. Einige dieser Polymere sind hochselektiv und inhibieren ausschließlich CatD, aber auch die Trypsin-Inhibitoren sind Hemmer des CatD. Die IC50-Werte liegen mit CatD zwar deutlich niedriger als mit Trypsin, eine Inhibierung in substöchiometrischen Konzentrationen erfolgt jedoch nicht. Die Pankreaslipase konnte als saures Enzym von einem CBS-haltigen Polymer mit ähnlichen IC50-Werten mit und ohne Substratmimetikum inhibiert werden. Diese Polymere sind hochspezifisch gegenüber den sonstigen getesteten Enzymen. Zur Kontrolle wurde das Thrombin als Blutgerinnungsfaktor untersucht. Es konnten keine inhibitorischen Effekte der Polymere auf das Thrombin beobachtet werden. Der Einbau substratmimetischer Monomere zeigte nicht die gewünschten Verbesserungen in der Inhibitorleistung der Polymere. Zwar traten vereinzelt leichte Verbesserungen der IC50-Werte auf, in den meisten Fällen blieben die Substratmimetika jedoch wirkungslos oder verschlechterten die inhibitorischen Effekte