Role of the von-Hippel-Lindau-Protein in the regulation of B-cell development

Bedingt durch die speziellen anatomischen Gegebenheiten des Knochenmarks findet die Blutbildung (Hämatopoese) im adulten Vertebraten innerhalb einer hypoxischen Mikroumgebung statt. Dabei sind einige hämatopoetische Stammzellen (HSZ) und auch Progenitorzellen der B-Zellreihe in knochennahen und damit außerordentlich sauerstoffarmen Arealen lokalisiert. Demzufolge könnte der Hypoxie-Signalweg innerhalb von HSZs und sich entwickelnden B-Zellprogenitoren eine wichtige funktionelle Rolle spielen. Der zentrale negative Regulator des Hypoxie-Signalwegs ist das von Hippel-Lindau-Protein (pVhl). Dementsprechend wurde innerhalb dieser Arbeit der Hypoxie-Signalweg mit Hilfe eines konditionalen Vhl-Allels in Kombination mit panhämatopoetischen (vav-iCre) oder B-Zell-spezifischen (CD19-/ Mb1-Cre) Cre-Rekombinasen in vivo modifiziert. Überraschenderweise zeigte die Analyse der panhämatopoetischen Vhl- Knockoutmäuse (Vhl KOvav) weder Veränderungen der Knochenmark-HSZ-Zahlen noch der HSZ-Zellzykluseigenschaften. Die Anzahl lymphatisch geprägter HSZs und lymphatischer Progenitoren im Knochenmark von Vhl KOvav-Mäusen war jedoch deutlich vermindert. Dieser quantitative Defekt setzte sich auch innerhalb der anschließenden B-Lymphopoese und der weiteren peripheren Differenzierung in Follikuläre (FOL) und Marginalzonen (MZ) B-Zellen fort. Auch CD5+-B1 B-Zellen der Peritonealhöhle waren in Vhl KOvav-Mäusen vermindert. Wie erwartet, wiesen Vhl KOvav-Mäuse eine expandierte Erythropoese insbesondere innerhalb der Milz auf. Um auszuschließen, dass der beobachtete B-Zellverlust durch einen Verdrängungs- oder Transeffekt der expandierten erythroiden Progenitoren zustande gekommen war, wurden B-Zell-spezifische Vhl-KO-Mäuse (Vhl KOCD19) generiert. Vhl KOCD19-Mäuse wiesen ebenfalls deutlich verminderte B-Zellzahlen innerhalb der Milz und der Peritonealhöhle auf. Somit musste der Vhl-KO-B-Zelldefekt durch einen B-Zell-intrinsischen Mechanismus zustande gekommen sein. Anschließend wurden die B-Zellen von Vhl- und Hypoxie-induzierender Faktor 1α (Hif1α) Doppel-KO-Mäusen (VhlHif1α KOCD19) analysiert, um zu zeigen, dass der genetische Vhl-Verlust seine negative Wirkung auf die B-Lymphopoese über den Hypoxie-Signalweg entfaltet. Der zusätzlich zum Vhl-KO eingezüchtete Hif1α-KO war in der Tat in der Lage, die B-Zellzahlen in der Milz und der Peritonealhöhle zu normalisieren. Damit war genetisch bewiesen, dass der beschriebene Vhl-KO-B-Zellphänotyp über den Hypoxie-Signalweg vermittelt wurde. Ein Cre-Transgen mit hoher Rekombinationseffizienz und früh in der BLymphopoese einsetzenden Aktivität stellt das Mb1-Cre-Transgen dar. Erwartungsgemäß war auch die Anzahl von unreifen Knochenmark-B-Zellen in Vhl KOMb1-Mäusen vermindert. Zusätzlich konnte im Vhl KOMb1-System nachgewiesen werden, dass die reduzierte Anzahl der im Blut zirkulierenden unreifen B-Zellen durch eine erhöhte Expression von Cxcr4 und damit durch eine gesteigerte nochenmarkretention verursacht sein könnte. Im peripheren Blut zeigte sich die CD62L-Expression unreifer Vhl KOMb1-B-Zellen erniedrigt, was wiederum ein reduziertes homing dieser Zellen in die peripheren lymphatischen Organe wie die Milz bewirkt haben könnte. In den residuellen B-Zellen der Vhl KOMb1-Milzen konnte eine gesteigerte Expression von Zielgenen des Hypoxie-Signalweges nachgewiesen werden. Insbesondere war das Zelltodinduzierende Gen Bnip3 in Vhl KOMb1-B-Zellen erhöht exprimiert. Dies war zudem auch mit der im Folgenden nachgewiesenen gesteigerten Apoptose- und Zelltodrate von Vhl KOMb1-Milz-B-Zellen vereinbar. Schließlich wurde untersucht, ob der genetische Vhl-Verlust in der Lage ist, die Entstehung einer B-Zell-spezifischen chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) zu unterdrücken. Hierfür wurde das TCL1-Transgen in den Vhl KOCD19- Hintergrund eingekreuzt. TCL1-Mäuse entwickeln nach ungefähr einem Jahr eine der humanen CLL ähnliche maligne Erkrankung. Im Alter von sieben Monaten war bei diesen Mäusen bereits eine ausgeprägte präleukämische Expansion CD5+-B-Zellen in der Peritonealhöhle, im Blut und in der Milz nachweisbar. Bemerkenswerterweise war das TCL1-Transgen im Vhl KOCD19-Hintergrund nicht imstande, eine präleukämische B-Zellexpansion zu induzieren. Zusammenfassend konnte innerhalb dieser Arbeit gezeigt werden, dass pVhl eine essentielle Rolle innerhalb der B-Zellentwicklung und -differenzierung spielt. Dabei reguliert pVhl die Migration und Zirkulation unreifer B-Zellen über Cxcr4 und CD62L und verhindert vermutlich einen Bnip3-induzierten Zelltod peripherer B-Zellpopulationen. Weiterhin sprechen unserer Daten dafür, dass die Entstehung einer CLL durch einen pVhl-Verlust verhindert werden kann.The production of blood cells (hematopoiesis) resides within the complex anatomic structure of the medullary bone cavity which provides a primarily hypoxic microenvironment. In particular, certain hematopoietic stem cell (HSC) subpopulations and progenitors of the B-cell lineage are located in close proximity to bone and oxygen-deprived areas. Therefore, the hypoxic-response-pathway might play an important functional role within HSCs and developing B-cell progenitors. The central negative regulator of the hypoxic-response-pathway is the von Hippel-Lindauprotein (pVhl). Within this thesis the hypoxic-response-pathway was genetically modified in mice by combining a conditional “floxed” Vhl-Allel with pan-hematopoietic (vav-iCre) or B-cell-specific (CD19-/ Mb1-Cre) Cre-recombinase transgenes. Unexpectedly, the analysis of pan-hematopoietic Vhl-knockout mice (Vhl KOvav) did neither reveal any changes within the bone marrow HSC compartment nor within the HSC cell-cycle state. However, the numbers of bone marrow lymphatic-primed HSCs, common and B-cell biased lymphoid progenitors were decreased in Vhl KOvav mice. This quantitative defect was sustained in subsequent B-progenitor stages and was even more pronounced within peripheral mature subsets such as follicular (FOL) and marginal zone (MZ) B-cells of the spleen. Furthermore, CD5+-B1 B-cells of the peritoneal cavity were decreased within Vhl KOvav mice. As expected, erythropoiesis was expanded in Vhl KOvav-mice, in particular within the spleen. In order to exclude that the observed B-cell deficiency was due to an inhibiting effect by the expanded erythroid progenitors, B-cell-specific-Vhl-KO-mice (Vhl KOCD19) were generated. These mice also exhibited decreased B-cell numbers within the spleen and peritoneal cavity. Thus, the Vhl-KO-B-cell-deficiency was caused by a B-cell intrinsic mechanism. Next, the B-cell lineage of Vhl and hypoxia-inducible factor 1α (Hif1α)-double-KO-mice (VhlHif1α KOCD19) was analyzed to interrogate whether the negative impact of the genetic Vhl-loss was mediated via the hypoxic-response-pathway. The addition of a Hif1α-KO to the Vhl-KO was indeed capable to completely rescue B-cell numbers of the spleen and the peritoneal cavity. Thereby, it was genetically proven, that the described Vhl-KO-B-cell-phenotype was caused by the de-inhibition of the hypoxic-response-pathway. Another Cre-line with high recombination-efficiency and early initiating activity within B-lymphopoiesis is the Mb1-Cre transgene. As expected, Vhl KOMb1-mice also showed decreased numbers of immature bone marrow B-cells. Additionally, it was demonstrated that reduced numbers of immature circulating blood Vhl KOMb1-B-cells were presumably caused by increased bone marrow retention due to increased Cxcr4-expression. Additionally, circulating immature B-cells expressed lower levels of CD62L likely interfering with their homing capabilities to peripheral lymphoid organs. Moreover, increased expression levels of core target genes of the hypoxic-responsepathway were detected in spleen Vhl KOMb1-B-cells. In particular, the cell-death inducing gene Bnip3 was highly expressed in Vhl KOMb1-B-cells. In line with these data, an increased apoptosis and cell death rate could be observed in Vhl KOMb1-Bcells. Finally, it was investigated whether genetic Vhl-loss is able to interfere with the development of chronic lymphocytic leukemia (CLL). For this purpose the CLLinducing TCL1-transgene was bred into the Vhl KOCD19-background. TCL1-mice develop a human CLL-like disease around one year of age. At seven months of age we observed a substantial preleukemic CD5+-B-cell-expansion within the peritoneal cavity, the peripheral blood, and the spleen of TCL1-mice. In contrast, the TCL1-transgene was not capable of expanding CD5+-B-cells in the Vhl KOCD19-background. In summary, this thesis could show that pVhl fulfills an essential role during B-celldevelopment and -differentiation. It was demonstrated that pVHL regulates B-cellmigration and homing via Cxcr4 and CD62L and presumably protects B-cells from Bnip3-induced cell death. Furthermore, the generated data suggest that Vhl-loss-offunction was able to prevent the development of CLL in mice