Studies on the implementation of CEACAM1-binding particles for diagnostic imaging of prostate cancer

Prostatakrebs stellt in Deutschland und in Europa mit ca. 60000 Neuerkrankungen im Jahr die häufigste Krebserkrankung bei Männern dar[3,4] und ist für ca. 10 % aller krebsassoziierten Todesfälle verantwortlich.[3,5] Für eine erfolgreiche Tumorbehandlung ist eine gesicherte Diagnose im sehr frühen Anfangsstadium der Krebsentwicklung erforderlich. Zu Beginn der Krebsentwicklung kann der Tumor noch ohne ein eigenes Versorgungssystem wachsen. Sobald er aber eine bestimmte Größe überschreitet muss er zum weiteren Wachstum ein eigenes Gefäßbett initiieren. Deshalb ist der Nachweis einer Neubildung von Blutgefäßen (Neoangiogenese) seit einiger Zeit im Fokus der Krebs-Diagnoseentwicklung. Diese Diagnostik sollte nicht-invasiv, kostengünstig und schnell durchführbar sein. Diese Voraussetzungen werden zurzeit nur von der Ultraschalldiagnostik erfüllt. Im Falle der Prostata-Diagnose werden Mikropartikel zur Kontrastverstärkung eingesetzt. Deren Verwendung, als molekulare Markersysteme zur zuverlässigen Darstellung des mikrovaskulären Tumorgefäßbetts, ist jedoch bisher nicht über tierbasierte in vivo Studien hinausgegangen, wie die aktuelle „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ des National Center for Biotechnology Information (US) zeigt.[153] Unsere Arbeitsgruppe identifizierte in vorangegangenen Studien CEACAM1 als Neoangiogenesemarker in Endothelzellen in neugebildeten Tumorblutgefäßen.[41] Eine spezifische Markierung dieses Proteins mit ultraschallgeeigneten Partikeln stellt ein neues molekulares Markersystem zur Visualisierung des Tumorgefäßbetts im Tumor-Frühstadium mittels Ultraschall dar. Daher wurde zunächst das kommerziell erhältliche Ultraschallkontrastmittel SonoVue [SV] der Firma Bracco mit einem in unserer Arbeitsgruppe entwickelten CEACAM1-spezifischen Antikörper beladen, um ein solches Markersystem zu generieren. Allerdings stellten sich dabei die [SV] Partikel, aufgrund ihrer geringen Stabilität und des Fehlens einer kovalenten Bindungsmöglichkeit für Antikörper, als gänzlich ungeeignet heraus. Die Bindung erfolgte hier lediglich über Adsorption. Eine solch gering affine Bindung ist aber für Anwendungen in der Angiologie, wo starke Scherkräfte auftreten, nicht ausreichend. Aus diesem Grund wurden weitere kommerziell erhältliche Partikel mit dem CEACAM1-spezifischen Antikörper beladen und analysiert. Eine Bindung an Protein G Partikel sollte hierbei die korrekte Ausrichtung der Antikörper sicherstellen. Die Bindung über das Biotin-Streptavidin System mit weiteren Partikeln gewährleistete dagegen die Flexibilität der Antikörper. Beide Systeme ermöglichten zudem kovalent ähnlichen Bindungscharakter. Für die Untersuchung der Bindungseigenschaften dieser CEACAM1-bindenden Partikel sollte als in vitro Testsystem die Endothelzelllinie eines Angiosarkoms der Kopfhaut (AS-M.5) eingesetzt werden, da diese unter anderem CEACAM1+ sind. Bei deren Verwendung bestand jedoch keine Möglichkeit, den Grad der unspezifischen Bindung CEACAM1-bindender Partikel zu analysieren. Daher wurde zunächst in einem in vitro Testsystem mit einer humanen CEACAM1 stabil transfizierten HeLa Zelllinie gearbeitet. Als Kontrolle und zum Nachweis unspezifischer Bindung stand somit die HeLa Wildtyp Zelllinie zur Verfügung. In unserer Arbeitsgruppe stand zusätzlich eine HeLa Zelllinie mit stabil transfizierten CEACAM8 zur Verfügung, welches normalerweise ausschließlich auf Granulocyten expremiert wird. Des Weiteren wird CEACAM8 nicht nur an Zell-Zell Kontaktstellen, sondern auch vermehrt apikal expremiert[85,86]. Zusätzlich ist es über eine GPI-Verankerung und nicht wie CEACAM1 transmembran an der Zellmembran gebunden, wodurch CEACAM8 eine höhere laterale Beweglichkeit in der Zellmembran besitzt[87]. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten jedoch, dass weder die Art der Membranverankerung noch die Lokalisation der Proteine einen Einfluss auf die Bindung antikörperbeladener Partikel hatte. Diese Zelllinie wurde daher ebenfalls zur parallelen Entwicklung einer Isotypenkontrolle zu den CEACAM1-bindenden Partikeln genutzt. Neben den [SV] Partikeln erwiesen sich auch die eingesetzten Roti-MagBeads Protein G [RPGB] Partikel der Firma Carl Roth aufgrund ihrer unspezifischen Bindung für die geplanten Anwendungen als nicht geeignet. Diese war so stark ausgeprägt, dass die Ergebnisse der Kontrollen nahezu identisch zu den Versuchsergebnissen waren. Die Targestar [TS] Partikel der Firma Targeson, die Dynabeads® M-280 Streptavidin [SDB] der Firma Invitrogen und die Protein G MicroBeads [MPGB] der Firma Miltenyi ergaben hingegen vielversprechende positive Resultate. So zeigten diese drei Partikelarten eine eindeutige antikörpervermittelte Bindung und lediglich bei den [SDB] Partikeln einen vernachlässigbaren unspezifischen Bindungsanteil. Allerdings können [MPGB] Partikel für ultraschallbasierte Diagnostik nicht verwendet werden, da Nanopartikel im Ultraschall nicht detektierbar sind.[89] Sie könnten jedoch bei Fragestellungen im Bereich von MRT-Untersuchungen eingesetzt werden. Für weiterführende Untersuchungen im in vitro Testsystem mit AS-M.5 Zellen sollten daher die vielversprechenden [TS] Partikel, welche speziell für in vivo Ultraschalluntersuchungen entwickelt wurden, und die [SDB] Partikel verwendet werden. Hierbei würden sich die [SDB] Partikel als Kontrollmarkersystem bei in vitro Untersuchungen anbieten. Trotz der eindeutigen Ergebnisse müssten die Partikel zur weiteren Verwendung modifiziert werden, da sie aufgrund ihrer Größe von Makrophagen erkannt und durch das Retikuloendotheliale System (RES) entfernt werden könnten.[134] Eine Maskierung zum Beispiel durch das Verwenden von Polyethylenglycolen würde dies verhindern.[125,135,136] Des Weiteren würden das Kopplungsprotein Streptavidin und das Fc-Fragment des gebundenen Antikörpers in humanen Anwendungen Immunogenität hervorrufen.[126,144] Diese Immunogenität aufgrund des Fc-Fragments könnte durch die Verwendung der F(ab)2-Fragmente umgangen werden, wobei die Beladung der Partikel über bivalente Crosslinker erfolgen müsste. Dadurch würde eine kovalente ortsspezifische Bindung erreicht und gleichzeitig der Einsatz eines Kopplungsproteins vermieden werden. Der Einsatz von Polyethylenglycolen mit entsprechenden reaktiven Endgruppen als Crosslinker würde zudem die Flexibilität und damit die Antigenerkennung aufrecht halten.[125] Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit den ersten Schritt bei der Etablierung CEACAM1 bindender Partikel für die bildgebende Diagnostik des Prostatakarzinoms darstellen. Dieses System würde sich sehr gut in die molekularen Markersysteme der „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ einfügen.[153]Prostate cancer is the most common cancer in men with about 60000 incidences per year in Germany and Europe and it is one of the leading causes of cancer-related death in men. [3,4,5] A very early confirmed diagnosis of prostate cancer is the basis for a successful cancer therapy. The reason for this is that tumors can develop only over a certain size, if they manage to initiate its own vascular bed. Therefore, detection of new blood vessels formation (neoangiogenesis) is the focus of novel cancer diagnosis strategies. Such diagnosis should be non-invasive, cost-efficient and easy realizable. Currently, this is only achieved by ultrasonication based detection systems. In the case of prostate cancer diagnosis micro particles are used for contrast enhancement of neoangiogenesis. But the application of micro particles as a molecular marker system in reliable visualization of the micro vascular bed of tumors is not yet beyond the point of animal in vivo studies, as documented by the current „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ of the National Center for Biotechnology Information (US).[153] In previous studies our group identified CEACAM1 as a novel marker for neoangiogenesis in endothelial cells of new-formed blood vessels. Thus, combining anti CEACAM1 antibodies with ultrasound detectable particles would lead in a new molecular marker system to visualize early stage tumor vessels via ultrasound. Hence, the goal of this work was the development of such a marker system by coupling specific anti CEACAM1 antibodies to a commercial available ultrasound contrast agent. The used antibodies were developed in our group previously. The first particle used was the commercial available ultrasound contrast agent SonoVue [SV]. But due to their low stability and the lack of covalently antibody coupling sites the [SV] particles were proven as not suitable for our application. The binding of antibodies to [SV] particles was achieved via adsorption only. Such low affine binding would not be sufficient for applications in angiology, where strong shear forces appear. Due to these results other commercial available particles were used for coupling CEACAM1 specific antibody in addition. The advantage of these other particles was the possibility to have a nearly covalent binding which was reached by using protein G particles and biotin particles. Hereby the use of protein G particles should guarantee the correct binding direction of the antibodies without influencing their functionality and biotin particles provided flexibility. To analyze the binding properties of the antibody loaded particles a CEACAM1+ endothelial cell line of an angiosarcoma of the scalp (AS-M.5) should be used as in vitro test system. In addition, HeLa wild type, HeLa-CEACAM1 and HeLa-CEACAM8 cell lines were used to identify particles with nonspecific binding. The differences between the two proteins CEACAM1 and CEACAM8 is their membrane localization and the kind of membrane binding. CEACAM1 is transmembrane anchored whereas CEACAM8 is membrane-bound via a GPI-anchor. Thus, in contrast to CEACAM1 CEACAM8 has a higher lateral mobility and is localized not only at cell-cell contact areas but also apical. [85,86,87] Due to the differences of the target proteins CEACAM1 and CEACAM8 it could be shown that neither the membrane anchorage nor the localization of the target protein had any influence on particle binding properties. In addition this cell line was used for parallel development of isotype control particles, resulting that the control particles were characterized in an analog test system like the normal particles. The achieved results demonstrated that next to the [SV] particles the used Roti-MagBeads Protein G [RPGB] particles of Carl Roth Company were not suitable for our applications as well. These particles had shown such high unspecific binding that the results of the control were more or less identical to the normal test results. In contrast, Targestar [TS] particles from Targeson, Dynabeads® M-280 Streptavidin [SDB] from Invitrogen and Protein G MicroBeads [MPGB] from Miltenyi were showing promising results. At all these different particles a distinct antibody mediated cell binding could be observed and only [SDB] particles showed negligible unspecific binding. Anyway, the usage of [MPGB] particles in ultrasonic based diagnostics would not be appropriate. Because of their size they would not be detectable by ultrasound. [89] Therefor they may be used in MRT applications. For prospective in vitro research with AS-M.5 cells [TS] and [SDB] particles should be used, in which [SDB] particles serve as a control marker system. Nevertheless a further development of both particles is required. Because of their size they can be identified by macrophages and removed by the reticuloendothelial system (RES), [134] which could be avoided by using a polyethylene glycol masking for example. [125,135,136] Another problem of the favored [TS] and [SDB] particles is caused by the coupling protein Streptavidin on the one hand and the Fc-fragment of the bound antibody on the other hand. These proteins would lead to an immunogenic reaction in human applications. [126,144] A simple way to overcome these problems is by the usage of F(ab)2-fragments, whereupon specific coupling to the particles could be achieved via a bifunctional Crosslinker. Polyethylene glycols with appropriate reactive groups could serve as crosslinker for this application, because simultaneously masking of the particles and flexibility for antigen recognition are given. [125] In summary the results of this work provide the first step of establishing CEACAM1 binding particles as a marker in molecular imaging of prostate cancer. This kind of system would extend the list of molecular marker systems as mentioned in the „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“.[153