Synthesis and characterization

Diese Forschungsarbeit ist Teil eines Verbundprojektes durch Zusammenarbeit mit dem Institut für Physiologische Chemie des Universitätsklinikums Essen unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Dr. Herbert de Groot. Das gemeinsame Bestreben der Kooperation ist die Entwicklung eines potentiellen Sauerstoffträgers für künstlichen Blutersatz in Form von perfluorcarbongefüllten Polymernanokapseln in wässriger Dispersion. Im Mittelpunkt der ersten Projektphase stehen die Ausarbeitung einer effizienten Synthesestrategie zur Präparation der Nanokapseln und eine Untersuchung geeigneter Charakterisierungs- bzw. Nachweismethoden. Perfluorcarbone sind vollständig oder auch partiell fluorierte Kohlenwasserstoffe mit einer hohen Aufnahme- und Abgabekapazität für respiratorische Gase wie Sauerstoff oder Kohlenstoffdioxid. Zudem sind sie chemisch und biologisch inert und ihr Vorrat ist quasi unbegrenzt. Ihre ausgeprägte Hydro- sowie Lipophobie veranlasst die Emulgierung von Perfluorcarbonen in einem wässrigen Medium, um ihre Aufnahme in den Blutkreislauf zu bewerkstelligen. Als nachteilig erweist sich jedoch die oftmals geringe Stabilität solcher Emulsionen und die damit verbundenen physiologischen Nebenwirkungen oder Begleiterscheinungen. Als Lösung bietet sich die Einkapselung der Emulsionstropfen innerhalb einer festen Polymerhülle an. Auf diesem Wege können sowohl eine Festigung der dispersen Struktur als auch eine Maskierung der Perfluorcarbontropfen erreicht werden. Zur Einkapselung von Perfluorcarbonen werden in dieser Arbeit im Wesentlichen zwei Prä-parationsansätze untersucht. Dabei handelt es sich zum Einen um eine Nanopartikelsynthese auf Grundlage des sogenannten Ouzo-Effekts, auch bekannt unter dem Begriff der spontanen Emulgierung, zum Anderen wird ein Einkapselungsverfahren getestet, das sich stärker an den Prozess der technischen Emulgierung und anschließender Lösemittelverdampfung anlehnt. Als Perfluorcarbon wird Perfluordecalin (PFD) verwendet. Als Kapselwandmaterial stehen die beiden Polymere Polybutylcyanacrylat (PBCA) und Polylactid-co-Glycolid (Polylactide-co-glycolic acid, PLGA) zur Verfügung. Im Zuge erster physiologischer Tests wird die Konzentration aber verstärkt auf die Präparation perfluordecalingefüllter Polybutylcyanacrylat-Nanokapseln gerichtet. Dafür wird die Synthesestrategie, basierend auf dem Ouzo-Effekt, in einem zweiten Schritt hinsichtlich des Monomer- und Tensidgehalts optimiert. Zur Charakterisierung der Nanokapseldispersionen stehen bildgebende Untersuchungsmethoden wie die Rasterkraftmikroskopie (AFM) und die Dunkelfeldmikroskopie zur Verfügung. Über kernresonanzspektroskopische Messmethoden (NMR) wird die Sauerstoffaufnahmekapazität der Kapseln untersucht. Zudem werden erste physiologische Tests von den Kooperationspartnern des Universitätsklinikums durchgeführt. Die durchschnittliche Partikelgröße und die Partikelgrößenverteilung werden über die Methode des Particle Tracking (PT), eine Kombination aus Dunkelfeldmikroskopie und digitaler Bildverarbeitung, bestimmt. Im Fall der optimierten PBCA-Nanokapseln liegt die durchschnittliche Partikelgröße im Bereich von 100 bis 300 nm im Radius. Mittels der Rasterkraftmikroskopie ist es möglich, die morphologischen Eigenschaften sowie die Elastizität der Kapseln durch kraftspektroskopische Experimente nachzuweisen. Einkerbungsversuche führen zu einer charakteristischen Faltung der Kapselhülle. Die Gasdurchlässigkeit der Polymerwand sowie die Gasaufnahmekapazität perfluordecalingefüllter PBCA-Nanokapseln werden mittels NMR untersucht. Hierdurch kann festgestellt werden, dass zwischen der chemischen Verschiebung des 19F-Signals von Perfluordecalin in reiner Form oder im eingekapselten Zustand und dem Sauerstoffgehalt ein linearer Zusammenhang besteht. In gleicher Weise korreliert die Spin-Gitter-Relaxationszeit T1 mit der Sauerstoffkonzentration. Darauf aufbauend werden sogenannte Gas-Kinetik-Experimente durchgeführt, wobei die Kapseldispersionen alternierend mit Sauerstoff und Stickstoff behandelt werden, um den Grad der Sauerstoffsättigung zu bestimmen. Im Rahmen erster physiologischer Beständigkeits- und Tauglichkeitstests werden von den Kooperationspartnern des Universitätklinikums ex vivo-/in vitro-Untersuchungen an den Kapseln durchgeführt. Hierfür werden Rattenlebern innerhalb eines extrakorporalen Zirkulationssystems mit den Kapseldispersionen perfundiert und physiologische Parameter im Vergleich mit Messungen an perfundierter Krebs-Henseleit-Pufferlösung kontrolliert. Hierbei lassen sich keine gravierenden Abweichungen und in einigen Fällen sogar ein verbessertes Resultat gegenüber den Kontrollwerten feststellen. Des Weiteren zeigen PT- und NMR-Untersuchungen der perfundierten Kapseldispersionen keine signifikanten Veränderungen der Partikelgrößenverteilung und der Fluorkonzentration auf.This research project is created in collaboration with the Institute for Physiological Chemistry at the University Hospital Essen headed by Professor de Groot. Goal of the cooperation is the development of a potential oxygen carrier as artificial blood substitute. As part thereof, synthesis and characterization of perfluorocarbon-filled polymer nanocapsules are central pillars of this study. Perfluorocarbons are fully or partly fluorinated hydrocarbons with high uptake and release capacity for respiratory gases such as oxygen and carbon dioxide. They are chemically and biologically inert and strongly hydro- and lipophobic. Due to that an efficient uptake of perfluorocarbons into the blood stream is only achieved after emulsification in aqueous media. However, so far the often inadequate stability of such emulsions and associated side effects have proved disadvantageous. A possible solution is the encapsulation of perfluorocarbon droplets into a polymeric shell. This allows both the stabilisation of the dispersed system and masking of the droplets. In order to encapsulate essentially two preparation techniques are investigated: firstly, the synthesis of nanoparticles via the Ouzo effect, a process also known as spontaneous emulsification and secondly, an encapsulation method that is based on a more technical emulsification practice and subsequent evaporation of the solvent. Perfluorodecalin (PFD) is chosen as the core material. The shell is made out of polybutyl cyanoacrylate (PBCA) or polylactide-co-glycolic acid (PLGA). For first physiological investigations focus is placed on the preparation of perfluorodecalin-filled PBCA nanocapsules. To improve the physiological compatibility of these nanocapsules the amount of PBCA monomer and surfactant are optimised. With regard to the characterisation of such nanocapsule dispersions imaging methods such as atomic force microscopy (AFM) and darkfield microscopy are available. Nuclear magnetic resonance (NMR) experiments are conducted to check the oxygen uptake capacity of the capsules. In addition first physiological test runs are made at the medical centre. The average particle size and particle size distribution is determined by particle tracking (PT). A combination of darkfield microscopy and digital image processing. In case of the optimised PBCA nanocapsules the average particle size is in the range of 100 to 300 nm in radius. Atomic force microscopy is used to verify morphological properties as well as the elasticity of the capsules via force spectroscopic measurements. Indentation experiments lead to a characteristic folding of the capsule shell. Gas permeability of the capsule shell and intake capacity of PFD-filled PBCA nanocapsules are investigated by nuclear magnetic resonance. A linear dependence between the chemical shift of the 19F signal of pure as well as encapsulated perfluorodecalin and the amount of oxygen can be observed. Similarly the spin-lattice relaxation time (T1) correlates to the oxygen concentration. On that basis gas-kinetic experiments are conducted whereas the capsule dispersions are treated alternately with oxygen and nitrogen to determine the degree of gas saturation. Ex-vivo/in-vitro tests regarding the stability and compatibility of the capsule dispersions are performed at the University hospital. Therefore rat livers are isolated and perfused within an extracorporeal circulation system. Control of physiological values show good results of capsule perfusion compared to perfusion with Krebs-Henseleit buffer solution. In addition PT and NMR analysis of the perfused capsules detect no significant changes of particle size distribution and Fluorine concentration