Characterization of the diaphanous related formin FHOD1 in the regulation of the actin cytoskeleton and its regulation by Rho GTPase signaling pathways

FHOD1 gehört zur Unterfamilie der Diaphanous-verwandten Formine, deren Aktivität durch die Rho-GTPasen vermittelte Aufhebung intramolekularer Wechselwirkungen reguliert wird. Eine konstitutiv aktive Mutante von FHOD1 ruft in Zellen die Generierung dicker Stressfaserbündel hervor. Jedoch sind die zelluläre Relevanz und die molekularen Mechanismen der FHOD1-vermittelten Aktin-Reorganisation nur sehr bruchstückhaft aufgeklärt. Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit die molekulare Rolle von FHOD1 in der Regulation des Aktinzytoskeletts sowie in komplexen Aktin-basierten Prozessen charakterisiert werden. Durch RNAi-vermittelte Depletion des endogenen FHOD1 in U2OS-Zellen sowie die Expression konstitutiv aktiver FHOD1-Mutanten konnten in dieser Arbeit distinkte Funktionen von FHOD1 bei der Generierung unterschiedlicher Stressfasertypen beschrieben werden. Die Depletion des endogenen FHOD1 führte zu starken Defekten in der Aktinzytoskelett-Organisation, die häufig im vollständigen Kollaps des Stressfasersystems resultierte. Diese massiven Störungen gingen mit der Inhibierung von dynamischen Protrusionen an der Zellfront sowie Defekten in der Maturierung und Auflösung fokaler Adhäsionen einher und führten schlussendlich zu einer signifikant verringerten Zellmigration. Detaillierte Studien der Stressfaserdynamik zeigten, dass aktives FHOD1 die Entstehung kontraktiler ventraler Stressfasern über die verstärkte Generierung transversaler Aktinbögen fördert. Im Gegensatz dazu inhibiert das Formin das Wachstum nicht-kontraktiler dorsaler Stressfasern. In Lokalisationsanalysen konnte die distinkte Assoziation von aktivem FHOD1 entlang der induzierten kontraktilen Fasern beobachtet werden, was auf eine direkte Rolle des Formins in der Generierung dieser Strukturen hinweist. Dabei deutet insbesondere die partielle Kolokalisation mit dem Motorprotein Myosin und der Ausschluss beider Proteine entlang nicht-kontraktiler dorsaler Stressfasern darauf hin, dass FHOD1 zusammen mit Myosin transversale Aktinbögen in einem kooperativen Prozess induziert. Auf molekularer Ebene deutet die Verstärkung der transversalen Aktinbögen durch FHOD1, in der primär kurze Aktinfilamente verknüpft und gebündelt werden, und die Inhibierung dorsaler Fasern auf eine duale Funktion des Formins als ein Capping- bzw. Aktinfilament-bündelndes Protein. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit grundlegende Erkenntnisse hinsichtlich der zellulären Funktion von FHOD1 in der Regulation des Aktinzytoskeletts und Aktin-basierten dynamischen Prozessen gewonnen werden. Die vorgestellten Befunde stellen die Grundlage für weiterführende Studien zum Verständnis der Formin-vermittelten molekularen Mechanismen der Aktinzytoskelett-Regulation dar.FHOD1 is a member of the subfamily of Diaphanous-related formins, which are activated by Rho GTPase mediated release of their intramolecular autoinhibition. The expression of an activated FHOD1 mutant induces the formation of thick stress fiber bundles in cells. However, the cellular relevance of this effect as well as molecular mechanisms leading to FHOD1 mediated stress fiber formation are not well understood. The aim of the present study was to characterize the molecular function of FHOD1 in the dynamic reorganization of the actin cytoskeleton and the role of formin mediated actin dynamics in actin-based cellular processes. RNAi-mediated depletion of endogenous FHOD1 as well as expression of constitutively active FHOD1 mutants revealed distinct functions of the formin during the generation of different stress fiber types in U2OS cells. Overall, depletion of FHOD1 lead to massive defects in the formation of actin stress fibers in the leading edge which often resulted in the entire collapse of the actin filament network. These striking defects were accompanied by decreased protrusion dynamics at the cell front as well as perturbed turn over of focal adhesions, ultimately leading to significantly decreased cell migration. Detailed studies of stress fiber dynamics showed that active FHOD1 leads to the accumulation of contractile ventral stress fibers due to enhanced formation of transversal arcs. In contrast, growth of non-contractile dorsal fibers was inhibited in cells expressing active FHOD1. Localization studies revealed distinct localization patterns of FHOD1 along the induced contractile stress fibers suggesting a direct function of the formin in the generation of these structures. Additionally active FHOD1 colocalized partially with Myosin at contractile stress fibers, whereas both proteins were absent along non-contractile dorsal fibers. These findings indicate a possible interplay of both proteins in the process of transversal arc generation. The FHOD1 mediated enhanced formation of transversal arcs, which are primarily formed by fusion and bundling of short actin filaments, along with the inhibited growth of dorsal stress fibers indicate a potential dual molecular function of the formin as a capping and actin bundling protein. In summary, the present work provides fundamental molecular knowledge of FHOD1 function and upstream regulatory mechanisms in the organization of the actin cytoskeleton. Thus, the presented findings offer a critical basis for future work to deepen our understanding of formin mediated actin-based dynamic processes