Die Rolle von Ubiquitinierung und des p97-UBXD1 Komplexes in der Regulation des endosomalen Transports von Caveolin-1

Caveolin-1 (CAV1) ist ein wichtiger struktureller Bestandteil cholesterinreicher Mikrodomänen in der Plasmamembran, die Caveolae genannt werden. Caveolae finden sich in den meisten Säugerzellen und sind and der Regulation zellulärer Signalübertragung, des Fettstoffwechsels und der Reaktion auf mechanische Reize beteiligt. CAV1 wird für seinen eigenen Abbau ubiquitiniert und im Lumen multivesikulärer Endosomen, die letztendlich mit Lysosomen fusionieren, sequestriert. Der Transport von CAV1 zum Lysosom erfordert, neben Komponenten der ESCRT-Maschinerie, auch die AAA-ATPase p97 zusammmen mit dem Kofaktor UBXD1. Es ist allerdings unbekannt, an welcher Stelle CAV1 ubiquitiniert wird und wie Ubiquitinierung von CAV1 und endosomaler Transport miteinander verknüpft sind. Weiterhin ist unbekannt, wie genau der p97-UBXD1 Komplex mit CAV1 interagiert und ob p97 als allgemeiner Regulator für den endosomalen Transport fungiert. Wir zeigen hier mittels systematischer Mutagenese, dass die Ubiquitinierung von CAV1 an einem beliebigen der sechs Lysine 5, 26, 30, 39, 47 und 57 in der N-terminalen Region stattfinden kann und dass die Mutation aller sechs Lysine zusammen notwendig ist, um die Ubiquitinierung zu verhindern. Die Ubiquitinierungsregion befindet sich in der flexiblen N-terminalen Region von CAV1, die nicht an der Oligomerisierung oder der Membranlokalisierung von CAV1 beteiligt ist. Bemerkenswerterweise behinderte die Mutation der Lysine 5 bis 57 den Transport von CAV1 zu frühen Endosomen. In der Folge akkumulierte CAV1 in einem frühen Transportschritt, der durch das caveoläre Hüllprotein PTRF/cavin-1 gekennzeichnet war. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Expression einer dominant negativen Variante von p97 den Transport von CAV1 in das Lumen später Endosomen verhindert. In der Folge zeigten wir hier, dass die Ubiquitinierungsregion in CAV1 sowohl für die Interaktion zwischen CAV1 und dem p97-UBXD1 Komplex als auch die Rekrutierung von p97-UBXD1 zu Endosomen notwendig war. Weiterhin akkumulierte ubiquitiniertes CAV1 nach zellulärer Depletion oder pharmakologischer Inhibition von p97. Diese experimentellen Daten weisen darauf hin, dass p97-UBXD1 zeitlich nach der Ubiquitinierung von CAV1 agiert und notwendig für die Prozessierung von ubiquitiniertem CAV1 an späten Endosomen ist. In diesem Zusammenhang zeigten wir weiterhin, dass p97 den lysosomalen Abbau von aktiviertem EGF Rezeptor vermittelte und deshalb als ein allgemeiner Regulator des endosomalen Transports agiert.Caveolin-1 (CAV1) is the main structural component of cholesterol-rich microdomains in the plasma membrane, called caveolae. Caveolae occur in most mammalian cells and are involved in the regulation of cell signaling, lipid homeostasis, and response to mechanical stress. For turnover, CAV1 is ubiquitinated and sequestered in the lumen of multivesicular endosomes that eventually fuse with lysosomes. In addition to components of the ESCRT machinery, lysosomal sorting of ubiquitinated CAV1 requires the AAA-ATPase p97 together with the cofactor UBXD1. However, it is unknown at which site CAV1 is ubiquitinated and how ubiquitination is linked to endosomal sorting of CAV1. Moreover, it is unknown how the p97-UBXD1 complex interacts with ubiquitinated CAV1 and if p97 is a general regulator of endosomal sorting. In this study, we show through systematic mutagenesis of lysine residues in CAV1 that ubiquitination of CAV1 occurs at any of the six lysines 5, 26, 30, 39, 47, and 57; and only the combined mutation of all six lysines together abolishes ubiquitination. The ubiquitination site is located in the flexible N-terminal region of CAV1 that is not involved in CAV1 oligomerization or membrane localization of CAV1. Importantly, mutation of the lysines 5 to 57 to arginine interfered with trafficking of CAV1 to early endosomes. As a consequence, the K5-57R variant accumulated at an early transport stage that was marked by the caveolar coat protein PTRF/cavin-1. Previous studies established that overexpression of dominant negative p97 prevents sorting of CAV1 into the lumen of late endosomes. Consistently, we showed here that the ubiquitination site in the N-terminal region of CAV1 was necessary for the interaction between CAV1 and p97-UBXD1 as well as recruitment of p97-UBXD1 to endosomes. Moreover, cellular depletion or pharmacological inhibition of p97 accumulated ubiquitinated CAV1. These results indicate that p97-UBXD1 acts downstream of CAV1 ubiquitination and is required for the turnover of ubiquitinated CAV1 on late endosomes. In this context, we demonstrated that p97 also mediated lysosomal degradation of ligand-activated EGF receptor and, thus, acts as a general regulator of endosomal sorting