Sepsis: Detection of bacterial RNA by murine and human pattern recognition receptors

Das Immunsystem der Vertebraten musste sich während der Evolution stetig verbessern, um sich ebenfalls stetig verändernde invasive Pathogene wie Bakterien, Viren und Parasiten als „Fremdkörper“ zu erkennen. Diese Aufgabe erfüllen Rezeptorgruppen, die sowohl membrangebunden in der Plasmamembran und im Endosom, als auch (frei) im Zytoplasma lokalisiert sind. Eine dieser Rezeptorgruppen sind die Toll-like Rezeptoren (TLR), die z. B. in der Erkennung von Gram-negativen Bakterien eine wichtige Rolle spielen. TLR2 und -4 gelten als Mediatoren der Gram-negativ induzierten Sepsispathologie. Sensoren Gram-positiver Bakterien neben TLR2 waren unbekannt. Untersuchungen von Myd88-/- und Unc93B1 defekten primären Mausmakrophagen implizierten neben fehlenden knock-out-Phänotypen für IL-1 Typ Zytokine die Involvierung eines endosomalen TLRs in die Erkennung des Gram-positiven Bakteriums Staphylococcus aureus. Im ersten Teil meiner Arbeit wurde TLR13, für den kein Ligand beschrieben war, als Rezeptor für ein spezifisches Segment Gram-positiv bakterieller 23S rRNA identifiziert. Durch Überexpression in HEK293 Zellen, Inaktivierung per Punktmutation, knock-down per siRNA Transfektion und knock-out, wurde die TLR13 Abhängigkeit der Erkennung des 23S rRNA Segments von S. aureus bestätigt. Zur Einengung der Liganden untersuchten wir drei hochkonservierte Strukturen mit bekannten Methylierungsmotiven, namentlich SaI, SaII und SaIII, auf ihr TLR13 Aktivierungspotential hin. Lediglich SaIII, das von Bakterien am zum Adenosin 2058 homologen Adenosin methyliert werden kann, induzierte die Expression proinflammatorischer Zytokine. SaIII wurde auf 19 Nukleotide und dann auf die Konsensussequenz GACGGAAAGACC eingeengt. Lokalisiert nahe dem katalytischen Zentrum des Ribosomen wird es durch MLS-Antibiotika gebunden, was die Proteinbiosynthese blockiert. Durch Überexpressionen von Methyltransferasen (ermC und ermB) in Escherichia coli verlor die jeweilige 23S rRNA ihr TLR13-stimu-latives Potential. Zusammengefasst implizierten meine Daten TLR13 als Rezeptor für eine spezifische Sequenz innerhalb der bakteriellen 23S rRNA, deren Methylierung oder Mutation die Bindung an MLS-Antibiotika und TLR13 verhindert. Im zweiten Projekt befasste ich mich mit der Frage, welche/r Rezeptor/en im Menschen, der lediglich TLR1-10 exprimiert, die Rolle von TLR13 als Sensor der 23S rRNA „übernommen“ hat/haben. Mononukleare Zellen (PBMC) induzierten nach Konfrontation mit Sa19 und mit der am A2058 Analogon (A7) methylierten Variante Sa19m proinflammatorische Zytokine. Auf der Suche nach einer responsiven Zelllinie identifizierte ich mit PMA 3 Tage differenzierte (3ddi) THP-1 Zellen als reaktiv im Gegensatz zu un- und 8 Tage differenzierten Zellen gegenüber Sa19. Parallel wurde ein Sa19-ähnliches Segment der mitochondriellen 16S rRNA identifiziert, namentlich BtmtD3_4, das ebenfalls stimulatorisch in Mensch-spezifischer Weise ist. Unsere Untersuchung der mRNA Expression von den dreierlei unterschiedlich differenzierten THP-1 Zellen implizierte TLR8 als möglichen Kandidaten, was durch siRNA vermittelten knock-down und die Überexpression in HEK293- und RAW246.7 Zellen erhärtet wurde. Weitere Untersuchungen von 3ddi Unc93b1-/-- sowie Tlr8-/- THP-1 Zellen unterstützten diese Daten. In THP-1 Zellen und PBMC induzierten die Total-RNA und die bakteriell- und ribosomalen 23S, 16S und 5S rRNA Fraktionen ebenfalls TLR8 abhängig proinflammatorische Zytokine. Durch die Applikation von T2.5, eines TLR2 spezifischen monoklonalem Antikörper, wurde die Responsivität von 3ddi Tlr8-/- THP-1- und Unc93b1-/- Zellen auf hitzeinaktivierten S. aureus und E. coli signifikant oder gar vollständig inhibiert. In PBMC die mit lebenden Bakterien infiziert wurden führte die Koapplikation von T2.5 und dem endosomalen Inhibitor Chloroquin zu einer ebenfalls weitgehenden Blockade der Zytokininduktion. Die erhobenen Daten schlagen die Blockade von TLR8 und -2 neben Antibiotikatherapie als therapeutischen Eingriff in den Frühphasen bakterieller Infektionen vor. Die RIG-I-like Helikasen (RLHs) sind neben TLR eine weitere Familie von Muster-erkennungsrezeptoren (PRR). Zu den im Zytoplasma lokalisierten Rezeptoren gehört RIG-I, der als viraler RNA Rezeptor fungiert. Untersuchungen von Mitgliedern unterschiedlicher Rezeptorfamilien auf ihre Responsivität nach Konfrontation mit Bakterien identifizierten RIG-I als Sensor für Gram-negative Bakterien. Die Konfrontation von RIG-I-überexprimierenden HEK293 Zellen identifizierte die tRNA als stimulative RNA Fraktion. Die Responsivität von Unc93B1 defekten Mausmakrophagen implizierte eine TLR3, -7, -8, -9, -11, -12, und -13 unabhängige Aktivie-rung. Die punktuelle 5`-Hydrolyse der Total- und tRNA von Gram-negativen Bakterien inhibierte deren stimulatorisches Potential und implizierte eine am 5`-Ter-minus pyro- oder triphosphorylierte RNA als aktivierende Struktur. Diese Ergebnisse beschreiben RIG-I auch als Sensor für Gram-negativ triphosphorylierte tRNA und nicht lediglich von viraler RNA.The immune system of vertebrates steadily improved during evolution to recognize constantly changing invasive pathogens such as bacteria, viruses and parasites. Pattern recognition receptors (PRR) localized in the plasma- or endosomal membrane and within the cytoplasm sense invading pathogens. Toll-like receptors (TLR) are one family of PRR that detect bacteria. TLR2 and 4 are major mediators of the sepsis pathology induced by Gram-negative bacterial infection. Specific sensors of Gram-positive bacteria besides TLR2 have been uncharacterized. MyD88- and Unc93B1 dependency combined with the lack of knock-out phenotypes for IL-1 type cytokines implied the involvement of an endosomal TLR in the recognition of the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus. In the first part of my work a specific segment of Gram-positive bacterial 23S rRNA was identified as ligand for the orphan receptor TLR13. The TLR13 dependent detection of S. aureus RNA was confirmed by TLR13 overexpression in HEK293 cells, knock-out, point mutation, and knock-down via siRNA. To narrow down the stimulatory sequence within the 23S rRNA, we investigated three highly conserved 23S rRNA segments with known methylation motifs, namely SaI, Sall and SaIII, and examined their potential to activate TLR13. Only SaIII containing the adenosine 2058 equivalent which confers resistance to antibiotics upon its methylation induced pro-inflammatory cytokine production. After reducing the length of SaIII to 19 nucleotides, we identified the consensus sequence GACGGAAAGACC. This sequence, located near the catalytic center of the ribosome, is bound by MLS antibiotics which blocks nascent protein growth. 23S rRNA lost its TLR13 stimulative potential by overexpression of methyltransferases (ermC and ermB) in Escherichia coli. In summary my data implied TLR13 as a receptor for a specific segment within the bacterial 23S rRNA. Methylation or mutation of A2058 prevents TLR13 recognition and binding of MLS antibiotics thereby causing escape from host surveillance and resistance, respectively. The second project dealt with the identification of the receptor/s that substitue/s for TLR13 as a sensor of bacterial 23S rRNA, since humans express merely TLR1-10. Mononuclear cells (PBMC) transfected with SA19 and its variant Sa19m, methylated at A7 (A2058 equivalent) both induced pro-inflammatory cytokine productions. Searching for an SA19 reactive cell line, I identified THP-1 cells differentiated with PMA for 3 days (3ddi) as responsive toward Sa19, while both undifferentiated and 8 ddi THP-1 cells are refractory. The Sa19-like mitochondrial 16S rRNA segment BtmtD3_4 also stimulated PBMC. However, its immune stimulatory potential was human specific. Our examination of the mRNA expression of 3ddi THP-1 cells implied TLR8 as possible candidate which was confirmed by siRNA mediated knock-down as well as over-expression in HEK293 and RAW246.7 cells. Further investigation of 3ddi Unc93b1-/-- and TLR8-/- THP-1 cell supported these data. The bacterial total RNA and each 23S, 16S and 5S rRNA fractions induced TLR8 dependent pro-inflammatory cytokine production in THP-1 cells and PBMCs. This stimulatory effect was significantly or even completely abrogated in 3ddi Tlr8-/-- and Unc93b1-/- THP-1 cells upon pretreatment with the TLR2 specific monoclonal antibody (T2.5). PBMC infection with living bacteria pretreated with T2.5 in combination with the endosomal inhibitor chloroquine also resulted in a substantial blockade of cytokine induction. Collectively, the data suggest TLR8/-2 blockade as possible therapeutic intervention in the early stage of bacterial infection induced sepsis. Another family of PRRs besides TLRs is the RIG-I-like helicase (RLH) family. Members of which are localized within the cytoplasm. One of their members, namely RIG-I, is a viral RNA receptor. In search for receptors recognizing bacteria we identified RIG-I as a sensor for Gram-negative bacteria. RIG-I overexpressing HEK293 cells confronted with bacterial RNA preparations identified tRNA as stimulative motiv. Also, responsiveness of Unc93B1 defective murine macrophages implied a TLR3, -7, -8, -9, -11, -12, -13 independent activation. The selective 5'-phosphohydrolysis of total and tRNA of Gram-negative bacteria inhibited their stimulatory potential and implied a 5`-pyro- or-triphosphorylated RNA as activating structure. These results describe RIG-I as a sensor not only for viral RNA but also for Gram-negative triphosphorylated tRNA