Untersuchungen zum dTDP-<small>L</small>-Mycarose-Biosyntheseweg des Erythromycin A-Produzenten <i>Saccharopolyspora erythraea</i> NRRL 2338

Ziel dieser Arbeit war die Überproduktion und die funktionelle Charakterisierung von fünf Enzymen des Biosynthesewegs von dTDP-L-Mycarose, einer Hexose-Komponente des Makrolidantibiotikums Erythromycin A. Die an der Biosynthese der dTDP-L-Mycarose des Erythromycin A-Produzenten Sac. erythraea NRRL 2338 beteiligten EryB-Proteine sowie einige der entsprechenden Dnm-Proteine aus dem Daunorubicin-Produzenten S. peucetius DSM 40754 wurden als lösliche native Proteine und/oder als His-tag-Fusionsproteine in E.coli und/oder in S.lividans produziert: EryBII (dTDP-2,6-Didesoxy-4-ketohexose 2,3-Reduktase), EryBIII (dTDP-2,6-Didesoxy-4-ketohexose 3-C-Methyltransferase), EryBIV (dTDP-2,6-Didesoxy-3-methyl-4-ketohexose 4-Reduktase), EryBVI, DnmT (dTDP-6-Desoxy-4-ketohexose 2,3-Dehydratase) und DnmU (dTDP-(2),6-Desoxy-4-ketohexose (3),5-Epimerase). Die Expressionsbedingungen wurden für jedes Gen individuell optimiert. Für die Genexpression in Streptomyceten wurden neue E.coli/Streptomyceten Shuttle-Vektoren konstruiert. In vitro Untersuchungen der enzymatischen Funktionen der an der dTDP-L-Mycarose-Biosynthese beteiligten Proteine lieferten weder Zwischenprodukte des Biosynthesewegs noch dTDP-L-Mycarose selbst. Das Protein DnmU aus S. peucetius wurde in Enzymtestansätzen als dTDP-6-Desoxy-4-keto-d-Glucose 3,5-Epimerase identifiziert. Das zu eryBVI homologe Gen tylCVI aus S. fradiae T59-235 wurde identifiziert, kloniert und sequenziert. Außerdem wurde das Gen midL aus S. mycarofaciens ATCC 21454 sequenziert. Die beiden abgeleiteten Genprodukte TylCVI und MidL besitzen 53,9% Sequenzidentität zueinander. EryBVI, TylCVI und MidL gehören zur Familie der Hexose 2,3-Dehydratasen Mutanten von Sac. erythraea mit Defekten in den Genen eryBII, eryBIII, eryBIV, eryBVI bzw. eryBVII wurden zu Komplementationsversuchen verwendet. Alle mit His-tag fusionierten EryB-Proteine waren in vivo aktiv. DnmU und EryBVII besitzen identische Enzymfunktionen. DnmT aus S. peucetius, TylCVI aus S. fradiae und MidL aus S. mycarofaciens besitzen die gleiche enzymatische Funktion wie die 2,3-Dehydratase EryBVI. The objective of this study was the overproduction and functional characterization of five enzymes involved in the biosynthesis of dTDP-L-mycarose a hexose moiety of the macrolide antibiotic erythromycin A. The EryB proteins involved in the dTDP-L-mycarose biosynthesis of the erythromycin A producer Sac. erythraea NRRL 2338 and some of the corresponding Dnm proteins from the daunorubicin producer S. peucetius DSM 40754 respectively were produced as soluble native and/or His-tag fusion proteins in E.coli and/or S.lividans: EryBII (dTDP-2,6-dideoxy-4-ketohexose 2,3-reductase), EryBIII (dTDP-2,6-dideoxy-4-ketohexose 3-C-methyltransferase), EryBIV (dTDP-2,6-dideoxy-3-methyl-4-ketohexose 4-reductase), EryBVI, DnmT (dTDP-6-deoxy-4-ketohexose 2,3-dehydratase) and DnmU (dTDP-(2),6-deoxy-4-ketohexose (3),5-epimerase). The expression conditions were optimised for each gene individually. New E.coli/ streptomycetes shuttle vectors were constructed for the gene expression in streptomycetes. In vitro enzymatic assays using the proteins mentioned above yielded neither intermediates of the dTDP-L-mycarose pathway nor dTDP-L-mycarose itself. In enzymatic assays the protein DnmU from S. peucetius was identified as dTDP-6-deoxy-4-keto-d-glucose 3,5-epimerase. The tylCVI gene of S. fradiae T59-235 which is homologous to eryBVI was identified, cloned and sequenced. Furthermore the gene midL from S. mycarofaciens ATCC 21454 was sequenced. The two deduced gene products TylCVI and MidL share 53.9% sequence identity. EryBVI, TylCVI and MidL are members of the hexose 2,3-dehydratase family. Sac. erythraea mutants with defects in the genes eryBII, eryBIII, eryBIV, eryBVI and eryBVII, respectively, were used in complementation assays. All EryB proteins with His-tag fusion were found to be active in vivo. DnmU and EryBVII possess identical enzymatic functions. The EryBVI homologous proteins DnmT from S. peucetius, TylCVI from S. fradiae and MidL from S. mycarofaciens exhibit the same enzymatic function as the 2,3-dehydratase EryBVI.