Derivation of hepatocyte like cells form human pluripotent stem cells

Ihmisen alkion kantasolut (hESC) ja ihmisen uudelleen ohjelmoidut monikykyiset kantasolut (hiPSC), yhteiseltä nimeltään ihmisen monikykyiset kantasolut (hPSC), pystyvät jakaantumaan rajattomasti solumaljalla sekä erilaistumaan kaikiksi aikuisen ihmisen solutyypeiksi. hPSC:t ovat ainutlaatuinen solulähde ihmisen kehitysbiologian tutkimukseen, tautimallinnukseen sekä regeneratiivisen lääketieteen käyttöön. hiPSC:t saattavat tulevaisuudessa mahdollistaa autologiset solusiirteet sekä tautispesifisten solujen, kuten geneettisestä maksasairaudesta kärsivien ihmisten hepatosyyttien tuotannon. Maksasairaudet ovat johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti ja ainoa hoitomuoto vakaviin maksasairauksiin on elinsiirto. Maksa on ihmisen aineenvaihdunnan keskus ja päävastuussa lääkeainemetaboliasta. Tämän vuoksi on erityisen tärkeää löytää uusia, parempia maksasolumalleja tautien patologiamekanismien tutkimiseen, lääkeaineiden kehittelyyn sekä uusien lääkeaineiden myrkyllisyyden arviointiin. Hepatosyyttejä onkin jo onnistuneesti erilaistettu hPSC:sta, mutta nykyiset menetelmät eivät pysty tuottamaan täysin toiminnallisia soluja. hPSC:n erilaitumista in vitro ohjataan stimuloimalla soluja sytokiineilla ja kasvutekijöillä, joiden tiedetään ohjaavan solujen erilaistumista myös in vivo. Tämän väitöskirjatyön ensimmäinen tavoite oli tutkia eri hPSC linjojen erilaistumispotentiaalia hepatosyyteiksi. Toinen tavoite oli tutkia miten Aktiviini/Nodal ja Wnt signaalien aktivoinnin kesto maksaerilaistuksen ensimmäisessä vaiheessa, definitiivisen endodermin (DE) erilaistuksessa, vaikuttaa DE solujen maksa- ja haima- erilaistuspotentiaaliin. Viimeisenä tavoitteena oli selvittää miten eri soluväliaineen proteiinit, kuten laminiinit, ja erilaiset kolmiulotteiset (3D) soluviljely-ympäristöt vaikuttavat hPSC:n hepatosyytti- erilaistukseen. Kaikki tutkimuksessa käytetyt hESC ja hiPSC linjat erilaistuivat hepatosyyteiksi. Tuloksemme kuitenkin osoittivat, että ne hiPSC linjat, jotka ovat uudelleenohjelmoitu genomiin integroituvilla retroviruksilla, omaavat potentiaalin transgeenien uudelleenaktivoitumiseen, mikä estää kyseisten linjojen mahdollisen kliinisen käytön. Lisäksi yksi retroviruksilla perustettu linja osoitti jatkuvaa transgeenista KLF4 ilmentymistä, mikä selkeästi häiritsi kyseisen linjan erilaistumista. Näistä syistä hiPSC linjojen teossa on siirrytty käyttämään pääasiassa menetelmiä, joissa transgeenit eivät integroidu solun genomiin. DE solut ovat yhteinen esisoluaste sekä haima- että maksasoluille. DE soluja voidaan erilaistaa hESC ja hiPSC linojoista aktivoimalla Aktiviini/Nodal sekä Wnt signaalireittejä. Tuloksemme osoittavat, että lyhytkestoinen Wnt signaalin aktivoiminen DE erilaistuksen aikana on suosiollista haimaerilaistukselle, kun pidempi Wnt aktivointi puolestaan tehostaa hepatosyyttien erilaistumista. Wnt aktivaatio myös tuki DE solujen pitkäaikaista viljelyä. Terveessä aikuisessa maksassa hepatosyytit eivät jakaannu, mutta kehityksen aikana epäkypsät hepatosyytit, heptaoblastit, jakaantuvat kiivaasti. Lisäksi aikuisessa maksassa hepatosyytit ovat hyvin heterogeenisiä ja hepatosyyttien toiminnallisuus riippuu solujen sijainnista maksassa. Hepatosyyttien toimintaa ohjaavat sekä signaalimolekyylit että soluväliaineen proteiinikoostumus. Tuloksemme osoittivat, että laboratoriossamme valmistettu laminiinirikas soluviljelyvalmiste, JAR-matrix, tuki hPSC linjojen erilaistumista hepatoblasteiksi. Lisäksi geeni-ilmentymisanalyysit osoittivat, että eri 3D soluviljely-ympäristöt tukivat eri maksageenien ilmentymistä; proteiinirikas Matrigeeli edesauttoi Albumiinin ilmentymistä ja solujen albumiinin eritystä, kun taas ainoastaan fysikaalinen 3D tuki edesauttoi metaboliaentsyymeitä koodaavin geenien ilmentymistä. Tuloksemme osoittavat, että soluja ympäröivät proteiinit että 3D- ympäristö säätelevät maksasolujen toiminnallisuutta. Tämä väitöstyö tarjoaa arvokasta biologista ja teknistä tietoa, joiden avulla maksasolujen erilaistusta hPSC linjoista voidaan tulevaisuudessa tehostaa.Human embryonic (hESC) and induced (hiPSC) pluripotent stem cells, collectively termed human pluripotent stem cells (hPSC), represent an unlimited cell source of self-renewing cells for studying human developmental biology, for disease modeling and for regenerative medicine due to their capacity to differentiate in all cell types in human body. hiPSCs may in the future enable generation of large quantities of autologous, patient derived disease-specific cells, such as parenchymal liver cells, hepatocytes. In addition to disease modeling, these cells would be valuable tools for drug discovery. Liver diseases are a leading cause of death worldwide and to date the only treatment for end stage liver disease is organ transplantation. Human liver is the metabolic center of the body and takes care of most of the xenobiotic metabolism and drug detoxification. Therefore, especially academic research and pharmacological industry is in urgent need for valid liver cell models for understanding disease pathogenesis, for drug discovery and toxicity evaluation. Successful hepatocyte differentiation from hPSCs has been described, however, so far described differentiation methods are unable to produce fully functional hepatocytes from hPSCs. The first aim of this thesis work was to evaluate variability in hepatic differentiation capacity of different hPSC lines. The second aim was to elucidate the role of Acitivin/Nodal and Wnt signaling during endoderm differentiation and to study how these signals are affecting on the capability of definitive endoderm (DE) cell to differentiate in hepatocytes and pancreatic cells. The last aim was to study the effect of specific extracellular matrix (ECM) proteins, laminins, and various 3D culture environments on hepatic differentiation from hPSCs. All hESCs and hiPSCs differentiated into hepatocyte like cells (HLC), however, the results revealed transgene reactivation and residual transgene expression in those hiPSC lines which were derived with genome integrating retrovirus-based method. Residual transgene expression hampered the cell differentiation troughout our study. Additionally, reactivation of transgenes increases the risk of tumor formation and thus hinders the clinical use of hiPSC lines generated with genome integrating method. Today, the field has moved essentially into integration free methods, such as Sendai-viral and episomal vector based systems, for hiPSC production. DE cells are precursors for both hepatic and pancreatic cells. DE-cells can be differentiated from hPSCs by activating Activin/Nodal and canonical Wnt signaling pathways. We showed that a short Wnt signaling activation in the beginning of DE differentiation is crucial for proper pancreas differentiation while longer Wnt activation favored hepatocyte differentiation. In addition, we showed that mixed hPSC/DE-cell population could be maintained in long-term cultures by activating Wnt signaling pathway. Mature hepatocytes are not proliferating in the healthy liver while fetal hepatoblasts are constantly dividing. We showed that our lab-made laminin rich ECM, JAR-matrix, is supporting the differentiation of hPSC into hepatic progenitor cells, hepatoblasts. Hence, JAR-matrix could be potential ECM preparation for hepatoblasts expansion. Two of the tested 3D approaches supported hPSC-derived HLCs viability and proliferation. ECM protein rich 3D environment enhanced Albumin secretion and Albumin gene expression in HLCs, whereas HLC aggregates in 3D environment without ECM proteins showed increased expression of metabolic genes. Our findings illustrated the importance of the cell culture environment for cellular identity of HLCs. Taken together, this thesis work provides valuable biological and technical information for the optimization of hepatocyte differentiation from hPSCs