RAB24 ja GOSR1-proteiinien vuorovaikutus ja rooli autofagiassa

Autophagy is a eukaryotic cellular process where intracellular material is recycled by transporting it in newly formed vesicles to lysosomes for degradation. In normal conditions autophagy supports cellular homeostasis. Different stress conditions can induce autophagy and then it helps the cell to avoid an unnecessary or uncontrolled cell death. RAB proteins are small GTPases that regulate vesicle traffic and fusion events in endocytic and exocytic pathways. RAB24 has recently been shown to participate in autophagy, but there is very little information about how it works at the molecular level. GOSR1 is a Golgi SNARE protein that regulates membrane fusion events, and it has been observed to interact indirectly with RAB24. The participation of GOSR1 in autophagy has not been studied yet. The aim of the study was to find out if RAB24 and GOSR1 colocalize into the same vesicle structures and if they interact within each other. HeLa cells were used as a model organism, and to induce autophagy amino acid starvation was used. For GOSR1 detection a DNA construct was created where GOSR1 was tagged with green fluorescent protein GFP-sequence. Localization was studied with immunofluorescence staining where in addition to RAB24 and GOSR1 also the autophagosomal marker protein LC3 was labeled. The labeled cells were photographed with a confocal microscope. The pictures were analyzed with ImagePro software. Interaction between the proteins was studied using immunoprecipitation. GOSR1 and RAB24 were not observed to colocalize into same structures in significant amount. Instead it was found that GOSR1 colocalized into LC3-positive autophagic vesicles. In immunoprecipitation studies no interaction between RAB24 and GOSR1 could be shown. In order to ensure the results more immunofluorescence stainings should be done using several time points and GFP-tagged GOSR1. Also GOSR1 silencing with siRNA should be used in order to find out if GOSR1 is necessary for autophagy. The immunoprecipitation protocol should be optimized, and the possible interaction could be studied by using other methods, for example yeast-two hybride technology.Autofagia on eukaryoottinen soluprosessi, jossa solunsisäistä materiaalia kierrätetään kuljettamalla sitä erikseen muodostuvissa vesikkeleissä lysosomeihin hajotettavaksi. Perustilan olosuhteissa autofagia ylläpitää solun homeostaasia. Erilaiset stressiolosuhteet voivat indusoida autofagiaa, jolloin se auttaa solua välttämään tarpeettoman tai hallitsemattoman solukuoleman. RAB-proteiinit ovat pieniä GTPaaseja, jotka säätelevät vesikkeliliikennettä ja -fuusiota endosytoosi- ja eksosytoosireitillä. RAB24:n on äskettäin osoitettu osallistuvan autofagiaan, mutta sen molekyylitason toiminnasta on hyvin vähän tietoa. GOSR1 on Golgin laitteeseen sijoittuva kalvojen yhtymistä säätelevä SNARE-proteiini, jonka on havaittu vuorovaikuttavan epäsuorasti RAB24:n kanssa. GOSR1:n osuutta autofagiassa ei ole tutkittu. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää paikantuvatko RAB24 ja GOSR1 samoihin vesikkelirakenteisiin ja vuorovaikuttavatko ne keskenään. Malliorganismina käytettiin HeLa-soluja, ja autofagian indusoimiseksi käytettiin näännytystä aminohapottomissa olosuhteissa. Tutkimuksia varten valmistettiin fuusioplasmidi, jossa GOSR1-sekvenssiin oli liitetty vihreän fluoresoivan proteiinin GFP-sekvenssi. Paikantumista selvitettiin immunofluoresenssivärjäyksellä, jossa leimattiin RAB24:n ja GOSR1:n lisäksi autofagosomaalinen merkkiproteiini LC3. Leimatut solut kuvattiin konfokaalimikroskoopilla, ja kuvia analysoitiin ImagePro-ohjelmistolla. Vuorovaikutusta tutkittiin immunopresipitaatiolla. GOSR1:n ja RAB24:n ei todettu merkittävästi paikantuvan samoihin rakenteisiin. Sen sijaan GOSR1 paikantui LC3-positiivisiin autofagisiin vesikkeleihin. Immunopresipitaatiokokeissa ei pystytty osoittamaan vuorovaikutusta GOSR1:n ja RAB24:n välillä. Tulosten varmistamiseksi immunofluoresenssivärjäyksiä tulisi tehdä enemmän ja useammassa aikapisteessä käyttäen GFP-leimattua GOSR1:stä. Jatkotutkimuksia olisi syytä tehdä myös käyttäen GOSR1:n siRNA-hiljennystä selvittämään, onko GOSR1 välttämätön autofagialle. Immunopresipitaatioprotokollaa tulisi optimoida, ja mahdollista vuorovaikutusta voisi tutkia myös muilla menetelmillä, esim. hiivan kaksoishybriditekniikalla