Detection of antibiotic resistant bacteria in cow’s milk through cultivation based and molecular biological methods

Antibiotikaresistente mikroorganismer er en av de største utfordringene vi møter i dag, og man vet foreløpig lite om hvordan resistente bakterier inntar matkjeden, men miljøet og næringsmidler i Norge er en mulig og lite undersøkt kilde. Disse næringsmidlene inkluderer melk, hvor det er gjort lite for å kartlegge hvilke typer resistensmekanismer som eksisterer i bakteriene, og hvorvidt disse kan spres til og bli et problem hos mennesker. Hensikten med denne oppgaven var å undersøke om det finnes antibiotikaresistente bakterier i melk fra kyr som aldri har fått antibiotika, og hva slags antibiotika de er resistente mot, samt hvilke resistensmekanismer som gir denne resistensen. Målet var å kartlegge resistensmekanismer i bakterielle isolater oppsamlet som en del av JurFrisk-prosjektet og undersøke spredningspotensialet, avvik fra villtyper, og klinisk relevans ved genotyping/sekvensering og MIC-bestemmelser. 81 isolater, isolert fra melk fra friske kyr, ble vekket til live fra glyserolstocks på blodagar. Prøvene ble sådd ut på ESBL-, CRE- og MRSA-skåler, i tillegg ble 12 isolater fra kyr med mastitt, som var plukket fra vekst på ESBL-skåler, også vekket for videre undersøkelser av hva som gjør dem resistente. DNA ble ekstrahert og alle resistente prøver ble screenet med PCR/qPCR multipleks for typiske resistensgener. DNA fra flere av disse prøvene ble helgenomsekvensert for å finne resistensgener og virulensgener. Alt dette skulle også ha blitt gjort med melkeprøver, men ingenting fra 40 forskjellige melkeprøver ga vekst på noen antibiotikaskåler. Hos de fryste prøvene var hver multipleks negativ, men det ble funnet mange resistens- og virulensgener i sekvenseringen. Bakteriene hadde gener som kan gi resistens mot mange typer antibiotika, som tetracyclin, fluoroquinoloner, rifampiner og betalaktamer, som betyr at det ble funnet forsvarsmekanismer mot alle de fire typiske angrepspunktene til antibiotika, nemlig proteinsyntesen, DNA-syntesen, RNA-syntesen og cellevegg-syntesen. Resistensmekanismene som ble oppdaget var både beskyttelse av angrepspunktet, inaktivering av antibiotika, modifisert angrepspunkt, og i all hovedsak efflukspumper. MIC-testene antydet en ervervet og klinisk relevant resistens hos enkelte av bakteriene, og det ble funnet gener forbundet med mobile genelementer, som kan bidra til økt spredning av resistens. Det ble også funnet mange virulensgener hos alle de resistente bakteriene, som kan hjelpe dem med kolonisering, overlevelse og spredning i verten, samt utgjøre ytterligere skade under en infeksjon. Tilsynelatende kan selv kyr som ikke får antibiotika være bærere, og bidra til spredningen av, virulente bakterier med klinisk relevante, ervervede resistensgener. Videre undersøkelser av dette kan være et ledd i å avdekke hvordan resistente mikrober kommer inn i matkjeden.Antibiotic resistant microorganisms are one of the biggest concerns of today, and little is known about how resistant bacteria enter the food chain, but the environment and foodstuffs in Norway is a possible and not thoroughly studied source. Among the foodstuffs is milk, where little is done to map what kind of resistance mechanisms exist in the bacteria, and whether this can spread to and become a problem in humans. The purpose of the work in this thesis was to search for antibiotic resistant bacteria in milk from cows that have never received antibiotics, and what kind of antibiotics they are resistant against, and what mechanisms grant this resistance. The goal was to map resistance mechanisms in bacterial isolates gathered as a part of the JurFrisk project, and study the proliferation potential, deviation from wild types and clinical relevance by genotyping/sequencing and MIC determinations. 81 isolates from the milk of healthy cows were grown on blood agar from deep frozen glycerol stocks, and then transferred to ESBL, CRE and MRSA plates. In addition to this, 12 isolates from cows with mastitis, which had already grown on ESBL plates, were re-cultivated for further study, to see what exactly gave them resistance. DNA was extracted and all resistant samples were screened for typical resistance genes using PCR/qPCR multiplexing. DNA from several of these samples was whole genome sequenced to find resistance and virulence genes. All of this was supposed to be done with milk samples as well, but none of the 40 milk samples gave a single colony on any of the antibiotic plates. Of the freezer samples, none of the multiplexes gave any positives, but several resistance and virulence genes were found by sequencing. They had genes that can grant resistance to many kinds of antibiotics, like tetracycline, fluoroquinolones, rifampins and betalactams, meaning they have defense mechanisms against the four main targets for antibiotics: the protein synthesis, the DNA synthesis, the RNA synthesis and the cell wall synthesis. The resistance mechanisms discovered was both protection of the target, inactivation of the antibiotic, modified target and, mainly, efflux pumps. The MIC testing suggested an acquired and clinically relevant resistance in some of the bacteria and it was also found genes associated with mobile genetic elements, that can cause an increased proliferation of resistance genes. Several virulence genes were also discovered in the resistant bacteria, that can aid the organisms in colonization, survival and proliferation in host, in addition to causing additional harm during an infection. It would seem that even cows that don’t receive antibiotics can carry, and help spread, virulent bacteria with clinically relevant, acquired resistance genes. Further studies could help discover how exactly resistant microbes enter the food chain.submittedVersionM-BIOTE