Biological vs. chemical regulation of nitrite concentrations in acidic and neutral pH soils : a study of kinetics and bacterial denitrifier communities

Denitrification is an anaerobic microbial respiratory process, which takes part in the global biogeochem- ical nitrogen cycle. Microbial denitrifiers contribute to the global recirculation of nitrogen, by stepwise reduction of nitrate (NO3–) to dinitrogen gas (N2), via nitrite (NO2-) and the gaseous intermediate prod- ucts nitric oxide (NO) and nitrous oxide (N2O). These gasses have a severe impact on the atmospheric chemistry. NO is involved in the formation of acid rain and of undesired ozone in the troposphere, while nitrous oxide (N2O) is the third most important greenhouse gas, and also the main destructor of stratospheric ozone. One major controller of denitrification in soil is the pH. Previous studies by NMBU Nitrogen group on Norwegian peat soils showed that NO2- concentrations were kept consistently low in low pH soils, while NO2- accumulated in neutral pH soils. Inversely, low pH soils accumulated large amounts of gaseous NO and N2O. While this has largely been attributed to the non-biological reduction of N-compounds to gaseous products, i.e. chemodenitrification, some form of biological control has not been completely excluded. The overarching goal of this thesis was to determine the significance of chemodenitrification compared to the enzymatic reduction of NO2- in both acidic and neutral pH peat soils. To gain insight into the community composition of the bacterial denitrifiers, I also quantified genes coding for denitrification reductases. Agricultural peat was sampled from an experimental site in Fjaler, on the west coast of Norway. I compared the production and consumption/apparent disappearance of NO2- and nitrogenous gases in three gamma- irradiated peat samples (pH 3.2, pH 5.2 and pH 7.2), and three non-sterilized peat samples (pH 3.8, pH 5.7 and pH 6.8). Gas kinetics was measured using an innovative robotized incubation system, and an ozone-based chemiluminescence approach was used to measure NO2- loss and production in peat. The chemiluminescence method for quantification of NO2-,which has scarcely been used to measure NO2- in soils, was found to be a rapid and sensitive method that can measure NO2- in the nM range, and arguably more precise than the more commonly used spectrophotometric assays, based on the Griess reaction. The method was therefore successfully used to measure the minute by minute loss of NO2- in peat. Accurate gas and NO2- data allowed for mathematical modelling of NO2- loss in sterilized peat, and further determination of the rate contribution of chemical degradation contrary to the enzymatic reduction of NO2- to NO. I found that partitioning of NO2- to peat particles occurs regardless of pH, within one minute of adding NO2- to sterilized and non-sterilized peat. Further, results show that NO2- protonates in acidic environments to produce mainly NO and some N2O. By modelling the nitrite kinetic of sterilized peat soils, I determined the rate of chemical decomposition in all peat soils. As expected, chemodenitrification rates were highest in the pH 3.8 peat soils, reducing all added nitrite within 5 hours, whereas nitrite was stable in pH 6.8 peat soils. Taking these NO2- decay rates into account, I found comparable nitrite reductase activities in both neutral and acidic peat soils, and verified that the biological reduction of NO2- in acidic peat soils is significant and more important than generally assumed. Gas kinetics from non-sterilized peat showed that acidic peat had a progressive onset of the denitrification gasses (NO, N2O and N2), while the pH neutral peat had an immediate production of all denitrification gasses. In accordance with earlier studies, the measurements on the bioactive peat showed that NO2- accumulated in the neutral pH peats, but not in the acidic peat. This may possibly be caused by a different regulation of denitrification in response to a strong selective pressure from an acidic environment. The abundance of the genes nirS (coding for nitrite reductase) relative to the 16S rRNA gene copies increased with increasing pH, while the opposite was true for the ratio of the nosZ/16S rRNA genes. The nosZ/nirS ratio was thus highest in the low pH soil, suggesting that the delayed reduction of N2O in the low pH soil was not due to a low genetic potential. Together, the results of this thesis paint a more complex picture of nitrite interactions in soil than previously hypothesized, where ion exchange, chemodenitrification and denitrification by bacterial communities play important and inter-linking roles in regulation.Denitrifikasjon er en anaerobisk mikrobiell prosess som deltar i den globale nitrogensyklusen. Mikrobielle denitrifiserere bidrar ved å stegvis redusere nitrat (NO–3) til dinitrogengass (N2), via mellomproduktene nitrogenmonoksid (NO) og dinitrogenmonoksid (N2O). Disse gassene er spesielt kjent for å ha negative virkninger på kjemien i Jordens atmosfære. Det er derfor av stor miljømessig interesse å lære mer om utslipp av disse gassene. NO er involvert i dannelsen av surt regn og uønsket ozon (O3) I troposfæren, mens N2O er den tredje mest viktige drivhusgassen, men også hoved nedbryteren av troposfærisk O3. En kontrollerende faktor for denitrifikasjon i jord er pH. Tidligere undersøkelser utført av Nitrogengruppen ved Norges universitet for miljø- og biovitenskap (NMBU) av norsk torvjord viste at NO–2-konsentrasjoner ble holdt konsekvent lav, i lav-pH jordprøver, mens NO–2 akkumulerte i nøytralpH jordprøver. Motsatt, i lav-pH jordprøver ble store mengder gassformet NO og N2O akkumulert. Selv om dette hovedsakelig har blitt forklart som en ikke-biologisk reduksjon av N-forbindelser (kjemodenitrifikasjon), så har ikke biologisk kontroll blitt helt avskrivet.Hovedmålet for denne oppgaven har vært å bestemme viktigheten av kjemodenitrifikasjon sammenlignet med enzymatisk reduksjon av NO–2 i både sur- og nøytral-pH torvjordsprøver. For å få bedre forståelse for samfunnsstrukturen til denitrifiserere mikroorganismer, kvantifiserte jeg også gener som koder for denitrifikasjonsreduktaser. Torvjord fra jordbruk ble samlet inn fra et eksperimentelt felt i Fjaler kommune, på vestkysten av Norge. Produksjonen og et tilsynelatende tap av NO–2 ble sammenlignet i tre gammabestrålte torvjordsprøver (pH 3,2, pH 5,2 og pH 7,2), og tre ikke-steriliserte torvjordsprøver (pH 3,8, pH 5,73 and pH 6,8). Gasskinetikk ble målt ved bruk av et innovativt, robotisert inkubasjonssystem, laget av Nitrogen gruppen ved NMBU. NO–2 i torv ble målt ved bruk av en ozon-basert kjemiluminiscens metode, som normalt sett ikke har blitt brukt til slike målinger i jord. Metoden var svært rask og sensitiv, og tapet av NO–2 kunne der med bli målt minutt-for-minutt, i konsentrasjoner helt ned i nM-området. Kjemiluminiscensmetoden er dermed mer følsom en de mer tradisjonelle spektrofotometriske metodene, slik som Griess-reaksjonen. Nøyaktige målinger av NO–2 , NO, N2O og N2 gjorde det mulig å matematisk modellere tap av NO–2 i sterilisert torvjord, og dermed bestemme de ratene som kjemiske og enzymatiske prosesser degraderer NO–2 med. Jeg har funnet at NO–2 binder seg til torvjordpartikler via ionebytting, uavhengig av de testede pH verdiene i torvjorden. Videre viser resultatene at NO–2 protoneres til HNO2 i surt miljø, som fører til produksjon av NO og noe mindre N2O. Modellering av kjemiske og mikrobiologiske gassproduksjons og gass nedbrytningsrater for NO–2 i både sterilisert og ikke-sterilisert torvjord, viser at det er hovedsakelig enzymatiske reaksjoner som er ansvarlige for produksjonen av NO i både surt og alkalisk miljø. Gasskinetikk viser at sur torvjord har en progressiv utvikling av denitrifikasjonsgasser (NO, N2O og N2, mens alkalisk jord produserer alle gasser med en gang. Det ble også vist at NO–2 akkumulerer i alkalisk jord, mens konsentrasjoner i sur jord ikke øker. Antall kopier av denitrifikasjonsgenet nirS var også funnet til å avta i sur torvjord, relativt til antall kopier av 16S rRNA genet, mens det motsatte var funnet for antall kopier av nosZ. Disse resultatene viser at biologiske prosesser er viktige i sur torvjord, og at det sannsynligvis er en annen form for regulering av denitrifikasjonsreduktaser med hensyn til pH.YaraM-M