Glykopeptideille vastustuskykyisten enterokokkien tunnistus PCR- ja mikrosiruhybridisaatio- tekniikoiden avulla

Enterokokit ovat gram-positiivisia bakteereita, jotka ovat osa ihmisen suoliston normaaliflooraa. Vaikka enterokokkeja pidetään yleisesti harmittomina, kuuluu sukuun useita lajeja, joiden tiedetään aiheuttavan mm. sepsikseen johtavia verenkiertoinfektioita ihmisissä. Koska enterokokit ovat luonnostaan vastustuskykyisiä lukuisille antibiooteille, on niiden aiheuttamien infektioiden lääkinnässä perinteisesti käytetty glykopeptidejä, joiden käyttö on yleensä aloitettu vasta kun muiden antibioottien teho ei riitä. Viime vuosien aikana glykopeptideille vastustuskykyisten enterokokkien (GRE) yleistyminen on kuitenkin tuottanut maailmanlaajuisesti ongelmia potilaan hoitoon ja sen myötä myös klinikoille ja mikrobiologianlaboratorioille, minkä vuoksi nopeiden ja tarkkojen menetelmien tarve GRE:n ja glykopeptideille herkkien enterokokkikantojen erottelemiseksi on merkittävästi kasvanut. Tässä tutkimuksessa kehitettiin PCR- ja mikrosirutekniikoiden yhdistelmään perustuva menetelmä kliinisesti merkittävimpien GRE:n tunnistamiseksi. Menetelmä kehitettiin osaksi kaupallista Prove-it™ Sepsis- testiä, jonka avulla jo ennestään pystyttiin tunnistamaan kaksi yleisintä enterokokkilajia, Enterococcus faecalis ja Enterococcus faecium. Tutkimuksen aikana testin tunnistuspaneelia laajennettiin glykopeptidiesistenssiä aiheuttavia ligaasi-entsyymejä koodaavilla vanA- ja vanB-geeneillä sekä kahdella luontaisesti glykopeptideille vastustuskykyisellä enterokokkilajilla, Enterococcus casseliflavusilla ja Enterococcus gallinarumilla. VanA- ja vanB-geeneille suunniteltiin alukkeet, joiden avulla Huslabista (Suomi) saatujen GRE-kantojen ligaasigeenit voitiin sekvensoida. Saadun sekvenssidatan perusteella suunniteltiin alukkeet molempien geenien spesifiseen monistukseen sekä tunnistuskoettimet alukkeiden monistamien PCR-tuotteiden tunnistamiseksi. E.casseliflavusin ja E.gallinarumin kohdalla tunnistus perustui Prove-it™ Sepsis yleisbakteeri-PCR:llä monistetun gyrB-geenin em. lajeille spesifisiin alueisiin, joihin suunniteltiin kummallekin lajille spesifiset tunnistuskoettimet. Suunnittelun tuloksena saatiin useita alukkeita vanA- ja vanB-geenien monistamista sekä useita tunnistuskoettimia alukkeiden monistamien tuotteiden tunnistamista varten. Myös E.gallinarum- ja E.casseliflavus-spesifisiä tunnistuskoettimia suunniteltiin useita. Sekä vanA- että vanB-geenien tunnistusta varten valittiin yksi alukepari, joka lisättiin osaksi Prove-it™ Sepsis -PCR:ää. Lisäksi kunkin kohdegeenin tunnistusta varten Prove-it™ Sepsis -mikrosirulle printattiin neljää erilaista geeni- tai lajispesifistä tunnistuskoetinta. Muokatulla Prove-it™-testillä testatiin 12 kliinistä alkuperää olevaa puhdasviljelmänäytettä, jotka saatiin pariisilaisen sairaalan, Hôspital de bicêtren, kliinisen mikrobiologian laboratoriosta. Testatuista näytteistä 11/12 tuotti PCR- ja mikrosiru-pohjaisella menetelmällä yhtenäisen tunnistuksen Hôspital de bicêtren referenssituloksiin verrattaessa.Enterococci is a group of gram positive bacteria part of human intestinal flora. While generally harmless, several species of the group are known to cause severe infections in humans, including bloodstream infections leading to sepsis. Since Enterococci are naturally resistant to many antibiotics, the use of glycopeptides, considered a”last resort” drugs, is common in treatment of enterococcal infections. In recent years, however, the emergence of glycopeptide resistant Enterococci (GRE) has been an increasing concern for clinics and microbiology laboratories around the world, creating a need for fast and accurate screening tests differentiating the glycopeptide resistant Enterococcus strains from the non-resistant ones. In this study, a combined PCR and microarray hybridization based method for identification of the clinically most prevalent GRE was established as a part of commercial sepsis diagnostic test called Prove-it™ Sepsis. Already identifying the most common Enterococcus species (E.faecium and E.faecalis), the detection of glycopeptide resistance causing ligase genes vanA and vanB and species level identification of intrinsically glycopeptide resistant E.gallinarum and E.casseliflavus were added as part of the the test. Primers were designed for sequencing vanA and vanB genes and multiple strains, provided by a Finnish clinical laboratory Huslab, were sequenced. Sequence regions unique to these genes were identified according to sequence alignment data containing the sequenced gene regions and other relevant sequences found in public sequence databases. Based on these data, primers were designed for the amplification of the selected gene regions. For identification of the amplified gene regions, a set of hybridization probes were designed and printed on microarray. In addition, probes for identifying E.casseliflavus and E.gallinarum were designed based on sequence aligment data gathered from Mobidiag Ltd. private biobank. The identification of these species was based on topoisomerase encoding gyrB gene amplified by the Prove-it™ Sepsis broad range PCR. Several primers for the amplification of vanA and vanB genes were designed and one primer pair for each was selected to be integrated to the Prove-it™ Sepsis multiplex-PCR. Similarily, multiple hybridization probes were designed for detecting vanA, vanB, E.casseliflavus and E. gallinarum. Four probes for each target gene region were selected to be integrated to the commercial test. With this modified test, 12 pure culture samples of clinical origin were tested and the results were compared to the ones provided by the laboratory of clinical microbiology of Hôspital de bicêtre (Paris, France). Results provided by the modified PCR and microarray test were identical to the reference results in 11 out of 12 cases