Obtenção de extratos padronizados em ácido clorogênico, rutina e isoquercitrina a partir das folhas de Morus nigra L. : inibição de tirosinase e citotoxicidade

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015.A melanogênese é um processo responsável pela produção de melanina, a qual é armazenada em melanócitos, que contêm tirosinase. Esta enzima é responsável pela hiperpigmentação da pele devido à superprodução de melanina. A inibição desta enzima é um alvo na indústria dos cosméticos, uma vez que controla condições indesejáveis da pele. Espécies de plantas do género Morus são conhecidas pelos usos benéficos oferecidos em diferentes partes da planta, incluindo a inibição da tirosinase. Assim, este projeto teve como objetivo estudar a atividade inibitória da tirosinase por extratos das folhas de Morusnigra, bem como a caracterização do perfil cromatográfico do seu extrato e viabilidade de incorporação em produtos cosméticos a partir de sua citotoxicidade, a fim de tornar-se uma nova opção terapêutica de fonte natural. Folhas de M. nigra foram coletadas, pulverizadas, igualmente divididas em cinco lotes e o extrato padronizado foi obtido por maceração passiva. Não houve diferença significativa entre os lotes para teor de sólidos totais, rendimento e teor de umidade, o que demonstra uma boa reprodutibilidade do processo de extração, também demonstrado pelo perfil cromatográfico de CCD. Atividade enzimática de tirosinase foi determinada para cada lote, fornecendo a percentagem de inibição da enzima e os valores de IC50 obtidos através da construção de curvas dose-resposta e comparados com o ácido kójico, um inibidor conhecido da tirosinase. Alta atividade de inibição da tirosinase foi observada (acima de 90% a 15,625 g/mL) e valores de IC50 entre 5,00 g/mL ± 0,23 e 8,49 g/mL ± 0,59, comparável ao ácido kójico (3,37 g/mL ± 0,65). De acordo com as diretrizes da ICH e da Anvisa, o método cromatográfico empregado utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi validado. A análise por CLAE revelou a presença de ácido clorogênico, rutina e, seu composto majoritário, isoquercitrina. Desta forma, o extrato padronizado das folhas de M. nigra foi padronizado utilizando estes polifenóis como marcadores. A citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio MTT em melanomas de murino (B16F10), queratinócitos humano (HaCat) e fibroblastos de camundongo (L-929). Não foi observada citotoxicidade para as linhagens celulares nos valores de IC50 da tirosinase. Este estudo demonstrou o potencial do extrato de M. nigra como um promissor agente de branqueamento de fonte natural contra hiperpigmentação cutânea.Melanogenesisis a process responsible formelanin production, whichis stored inmelanocytes containing tyrosinase. This enzyme is responsible forskin hyperpigmentationdueto the overproduction of melanin. Inhibitionof this enzymeis a targetin the cosmetics industry, since it controls undesirable skin conditions. Plant speciesof theMorusgenusare knownfor the beneficial usesofferedin different partsofthe plant,includingtyrosinase inhibition. Thus, thisproject aimedto study the inhibitory activity of tyrosinase by extracts from Morusnigra leaves, as wellas the characterizationof the chromatographic profileofits extractandviabilityofincorporationin cosmetics fromtheir cytotoxicity,in order tobecome a newtherapeutic optionfrom anatural source. M.nigraleaveswere collected, pulverized, equally divided into five batches and the standardized extractwas obtained bypassivemaceration. There was no significant difference between batches for total solids content, yield and moisture content, which shows good reproducibility of the extraction process also demonstrated by TLC chromatographic profile. Tyrosinase enzymatic activitywas determined for each batch, providingthe percentage ofenzyme inhibitionand IC50valuesobtainedby constructingdose-response curvesand compared with kojic acid, a well-known tyrosinase inhibitor. High inhibition of tyrosinase activity was observed (above 90 % at 15,625 g/mL) and IC50 values ranging from 5.00 g/mL ± 0.23 to 8.49 g/mL ± 0.59, comparable to kojic acid (3.37 g/mL ± 0.65). According to ICH and Anvisa guidelines, the chromatographic method employed usingHigh Profile Liquid Chromatography (HPLC) was validated. HPLC analysis revealed the presence of chlorogenic acid, rutin and its major compound, isoquercitrin. Thus, M. nigra leaf extract was standardized using these polyphenols as markers. Cytotoxicity wasassessed by MTT assay on murine melanomas (B16F10), humankeratinocytes (HaCat) andmouse fibroblasts (L-929). Cytotoxicity was not observed to the cell lines in tyrosinase IC50 values. This study demonstrated the potential of M. nigra extract as a promising whitening agent of natural source against skin hyperpigmentation