Modificações genéticas em leveduras para expressão de celulases

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012.A produção de etanol lignocelulósico transformou-se em um grande desafio para a indústria de energia renovável. A celulose presente nos resíduos lignocelulósicos representa uma fonte abundante de açúcares, mas estes só se tornam disponíveis para fermentação após a etapa de hidrólise enzimática. As grandes quantidades de enzimas necessárias impactam severamente a relação custo-eficácia desta tecnologia. No sentido de buscar novas alternativas, conduzimos o trabalho com o intuito de construir linhagens das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris capazes de produzir celulases (endoglicanase, celobiohidrolase e β-glicosidase). A primeira etapa para a produção de uma linhagem de S. cerevisiae produtora de celulases, foi a expressão isolada de genes celulolíticos. A expressão da endoglicanase II (eglII) de Trichoderma reesei e da celobiohidrolase I.1 (cbhI.1) de Phanerochaete chrysosporium em S. cerevisiae linhagem MFL gerou clones produtores de enzimas funcionais no sobrenadante do cultivo. Em ambos os clones selecionados para cada enzima, foi detectada atividade enzimática a partir de 24 h de cultivo, atingindo maior atividade após 96 h. Várias estratégias para expressão de β-glicosidases em S. cerevisiae foram abordadas: i) a expressão da BGL1 de Sacharomycopsis fibuligera em sua forma nativa, ii) fusionada ao C-terminal da α-aglutinina e, iii) com o peptídeo sinal do fator α de S. cerevisiae. As duas últimas estratégias também foram realizadas com a BGL4 do fungo Humicola grisea var. thermoidea. Testou-se, ainda, a co-expressão da β-glicosidase intracelular GH1-1 e do transportador de celodextrinas CDT-1 de Neurospora crassa. Dentre todos os genes e estratégia utilizados, apenas o sistema envolvendo a co-expressão da GH1-1 e do CDT-1 apresentou resultado satisfatório. O sistema provou ser eficiente permitindo que a levedura crescesse na presença de celobiose em condições aeróbicas e anaeróbicas, com produção de etanol na segunda condição. A co-expressão dos genes eglII e cbhI.1 foi em seguida testada na forma de “fusões gênicas” utilizando dois sistemas de clivagem in vivo: a sequência autoclivante 2A do vírus FMDV, e o sítio para a endoprotease Kex2p. Os dois sistemas resultaram em enzimas funcionais, no entanto as atividades foram menores do que aquelas obtidas quando as enzimas foram expressas separadamente (possivelmente devido ao saturamento da via de secreção). Finalmente, no sentindo de obter uma linhagem de S. cerevisiae que expressasse as três cellulases, foi feita a co-expressão das fusões gênicas com o sistema β-glicosidase/transportador. O clone selecionado GH1-Fus2A apresentou atividade enzimática sobre os substratos CMC e pNPC, capacidade de crescimento em celobiose e seu consumo, e produção de etanol, indicando a produção das três enzimas celulolíticas funcionais na mesma levedura. Para a obtenção de uma linhagem de P. pastoris recombinante produtora de celulases, os genes dessas enzimas foram clonados sob o controle do forte promotor induzível AOX1, em vetores integrativos. Foram utilizados os genes eglII e cbhI.1 em fusão gênica com a sequencia 2A. As atividades sobre CMC, Sigmacel e papel de filtro foram detectadas no sobrenadantes da linhagem recombinante, nas primeiras horas de indução, sendo os maiores níveis encontrados após 72 h, confirmando a atividade das enzimas EGLII e CBHI.1. A atividade sobre CMC do clone recombinante de P. pastoris foi aproximadamente 8 vezes superior àquela obtida com o clone recombinante de S. cerevisiae expressando a mesma fusão gênica. A análise do sobrenadante do cultivo por SDS-PAGE mostrou a clivagem da proteína de fusão pelo peptídeo 2A gerando proteínas independentes. Por fim, demonstrou-se a construção de linhagens de S. cerevisiae e de P. pastoris produtora de celulases necessárias para a degradação da celulose. Essas leveduras são apontadas como uma interessante plataforma para a produção de proteínas heterólogas, e com isso diminuir a quantidade de enzimas comerciais necessárias para hidrolisar o substrato, contribuindo para a redução da dependência da importação das enzimas. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe production of lignocellulosic ethanol become a great challenge for the renewable energy industry. Cellulose present in the lignocellulosic residues represents an abundant source of sugars, but these are only available for the fermentation process after an enzymatic hydrolysis step. The large amount of enzymes required severely impacts the overall cost-efficacy relation of this technology. In an effort to pursue new alternatives, we performed this work aiming to construct strains of Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris able to produce cellulases (endoglucanase, celobiohydrolase and β-glucosidase). The first step for the production of the S. cerevisiae strain that produces cellulose was the isolated expression of cellulolitcs genes. The single expression of the endoglucanase II of Trichoderma reesei and of the cellobiohydrolase I.1 of Phanerochaete chrysosporium in S. cerevisiae MFL generated clones producing functional enzymes on the culture supernatant. In both selected clones for each enzyme, the enzymatic activity was detected after 24 h of cultivation, reaching the highest activity after 96 h. Many strategies for the expression of β-glucosidases in S. cerevisiae were performed: i) the expression of BGL1 de Sacharomycopsis fibuligera in its native form, ii) fused to C-terminal of α-aglutinin and, iii) with the signal peptide form the S. cerevisiae α-factor. The last two strategies were also performed with BGL4 from the fungus Humicola grisea var. thermoidea. It was also tested the co-expression of the intracellular β-glucosidase GH1-1 and the cellodextrins transporter CDT-1 of Neurospora crassa. Of all those strategies, only the system involving the co-expression of GH1-1 and CDT-1 showed satisfactory results. The system showed to be efficient allowing the growth of the yeast in the presence of cellobiose both in aerobic and anaerobic conditions, with ethanol production in the latter. Then, the co-expression of eglII and cbhI.1 genes was tested in the form of “gene fusions” using two in vivo cleavage systems: the auto-cleavage 2A sequence from the FMDV virus, and the cleavage site for the Kex2p protease. Both systems result in functional enzymes, however the activities were lower than those obtained when the enzymes were expressed separately, possibly due the saturation of the secretion pathway. Finally, in an effort to obtain a S. cerevisiae strain that expresses the three cellulases, it was made the co-expression of gene fusion with the β-glucosidase/transporter system. The selected clone GH1-Fus2A showed enzymatic activity with the substrates CMC and pNPC, capacity of growing in cellobiose and consumes it, and ethanol production, indicating the production of the three functional cellulolitic enzymes in the same yeast. To obtain a recombinant P. pastoris strain producing cellulases, the genes of these enzymes were cloned into an integrative vector under the control of the strong inducible promoter AOX1. It was used the eglII and cbhI.1 genes in a gene fusion with the autoclivable 2A sequence. Enzymatic activities with the substrates CMC, Sigmacel and filter paper were detected on the supernatant of the recombinant strain, confirming the enzymes activities of EGLII and CBH.1. The enzymatic activities were detected during the first hours of induction, where the highest levels occurred after 72h. The activity with CMC of the recombinant clone of P. pastoris was approximately 8-fold higher than that obtained with the recombinant clone in S. cerevisiae expressing the same gene fusion. Analysis of the culture supernatant through SDS-PAGE showed the protein fusion cleavage by the 2A peptide generating independent proteins. Finally, it was shown the construction of S. cerevisiae and P. pastoris strains producing cellulases necessary for the cellulose degradation. These yeasts are pointed out as an interesting platform for heterologous protein production and diminishing the amount of commercial enzymes needed to hydrolyze the substrate contribute to the decrease of the dependence of enzymes importation