Study of the haemoplasma infections in domestic dogs and cats

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2015.Hemoplasmas são micoplasmas hemotrópicos que não possuem parede celular e crescem na superfície de eritrócitos podendo causar anemia infecciosa em diferentes espécies de mamíferos. Gatos são infectados por três espécies principais: Mycoplasma haemofelis (Mhf), ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’ (CMhm) e ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’ (CMt) e em cães as espécies Mycoplasma haemocanis (Mhc) e ‘Candidatus Mycoplasma haematoparvum’ (CMhp) são as mais prevalentes. O presente estudo teve como objetivos determinar a ocorrência e a filogenia das espécies de hemoplasmas em gatos da capital do Brasil e cidades satélites e de cães da Nigéria, África, e verificar se há correlação com alterações hematológicas. Amostras de sangue foram coletadas de 451 gatos de diferentes origens de Brasília, DF e de 246 cães de Jos, Plateau State, Nigeria e submetidas a avaliação eritrocitária e extração de DNA para PCRs e sequenciamento. No estudo em gatos, hemoplasmas foram encontrados em 13.8% dos animais. CMhm foi a espécie mais prevalente (13.8% dos gatos), seguida pelo Mhf (11.1%) e CMt (4.4%). Mais de 80% dos gatos infectados por hemoplasmas estavam infectados por duas ou mais espécies: 7.1% estavam co-infectados com Mhf/CMhm, 0,4% com CMhm/CMt e 3,9% com Mhf/CMhm/CMt. O gênero masculino estava significativamente associado com infecção por hemoplasmas. Nenhuma associação entre o resultado da qPCR para hemoplasmas e parâmetros hematológicos foi encontrada, porém o número relativo de cópias de CMhm apresentou correlação com o número de eritrócitos e hematócrito. As sequencias do gene 16S rRNA (>1Kb) das espécies de hemoplasmas provenientes de gatos com co-infecções foram obtidos usando oligonucleotídeos espécie específicos, o que permitiu a obtenção de sequencias do gene 16S rRNA apesar do alto nível de co-infecções, que impossibilita o uso de oligonucleotídeos universais para o gene 16S rRNA. Dentro de cada espécie as sequencias de Mhf, CMhm e CMt apresentaram identidade de >99.8%, >98.5% e >98.8%,respectivamente. As sequencias de Mhf, CMhm e CMt apresentaram >99.2%, >98.4% e >97.8% de identidade, respectivamente, com sequencias do GenBank. A análise filogenética demonstrou todas as sequencias do Mhf em um único grupo, enquanto as sequencias de CMhm e CMt se agruparam em 3 subgrupos distintos. Estes achados filogenéticos sugerem a existência de diferentes cepas de CMhm e CMt. No estudo em cães, a qPCR espécie específica detectou infecção por Mhc em 18 dos 245 cães (7,3%) e CMhp em apenas um cão (0,4%). A qPCR de gênero de hemoplasmas foi positiva em 44 dos 245 (17,9%) dos cães. Vinte e cinco cães tiveram resultados discordantes nas qPCRs, nos quais foram positivos na qPCR de gênero de hemoplasmas, mas negativos na qPCR espécie específica. A avaliação desses cães discordantes por meio do sequenciamento do gene 16S rRNA gerou resultados limitados, mas em 5 cães confirmou-se a infecção por espécies diferentes de hemoplasmas: 2 Anaplasma phagocytophilum, 1 Anaplasma ovis, 1 Serratia marcescens e 1 Aerococcus spp. O sequenciamento do gene 16S rRNA dos Mhc mostrou >99,8% de identidade entre elas e >99,6% de identidade com sequencias disponíveis no GenBank e permaneceram no mesmo grupo de outras sequencias de Mhc e Mycoplasma haemofelis, indicando baixa variabilidade genética do gene 16S rRNA entre Mhc de diferentes origens.Haemoplasmas are wall less haemotropic mycoplasmas that attach and grown in the surface of erythrocytes and cause anaemia in different mammals species. Cats are infected with three main species: Mycoplasma haemofelis (Mhf), ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’ (CMhm) and ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’ (CMt), while in dogs the species Mycoplasma haemocanis (Mhc) and ‘Candidatus Mycoplasma haematoparvum’ (CMhp) are the most prevalent. The aims of the present study were to determine the occurrence and the phylogeny of haemoplasma species from cats in Brasilia and surrounding cities and from dogs in Nigeria, Africa; and assess weather any correlation existed between haemoplasma infection and haematological abnormalities. Blood samples were collected from 451 cats in different origins of Brasília, DF and from 246 dogs from Jos, Plateau State, Nigeria; submitted to erythrocyte evaluation and DNA extraction for PCR analysis and sequencing. In the cats study, haemoplasmas were found in 13.8% of 432 cats. CMhm was the most prevalent species (in 13.8% of cats), followed by Mhf (11.1%) and CMt (4.4%). Over 80% of haemoplasma-infected cats harboured two or more feline haemoplasma species: 7.1% of cats were co-infected with Mhf/CMhm, 0.4% with CMhm/CMt and 3.9% with Mhf/CMhm/CMt. Male gender was significantly associated with haemoplasma infections. No association was found between qPCR haemoplasma status and haematological variables, however CMhm relative copy numbers were correlated with red blood cell (RBC) numbers and packed cell volume (PCV). Haemoplasma 16S rRNA gene sequences (>1Kb) were derived from co-infected cats using novel haemoplasma species-specific oligonucleotides. This allowed 16S rRNA gene sequences to be obtained despite the high level of co-infection, which precluded the use of universal 16S rRNA gene oligonucleotides. Within each species, the Mhf, CMhm and CMt sequences showed >99.8%, >98.5% and >98.8% identity, respectively. The Mhf, CMhm and CMt sequences showed >99.2%, >98.4% and >97.8% identity, respectively, with GenBank sequences. Phylogenetic analysis showed all Mhf sequences to reside in a single clade, whereas the CMhm and CMt sequences each grouped into three distinct subclades. These phylogeny findings suggest the existence of different CMhm and CMt strains. In the dogs study, species-specific qPCR assays found Mhc infection in 18 of 245 dogs (7.3%), and CMhp infection in only one dog (0.4%). The generic haemoplasma qPCR assays were positive in 44 of 245 (17.9%) dogs. Twenty-five dogs had discordant qPCR results in that they were generic haemoplasma qPCR positive but species-specific qPCR negative. Further evaluation of these dogs by 16S rDNA sequencing gave limited results but 5 were confirmed to be infected with non-haemoplasma species: The 16S rRNA gene sequences from Mhc species showed >99.8% identity with each other and >99.6% identity with GenBank sequences, and resided in a single clade with other global Mhc and Mycoplasma haemofelis sequences, indicating low 16S rRNA genetic variability amongst this canine haemoplasma species