Avaliação dos efeitos biológicos dos inibidores do mTOR associados ou não à radioterapia em linhagem celular de carcinoma do colo do útero

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015.A via de sinalização PI3K/AKT/mTOR está frequentemente ativada nos carcinomas de células escamosas HPV-positivos, nos quais se inclui o câncer escamoso do colo do útero. Assim, esse trabalho propõe-se avaliar os efeitos biológicos dos inibidores do mTOR associados ou não à radioterapia em células de câncer do colo do útero HPV positiva. Foram utilizadas linhagens de células de câncer do colo do útero (HeLa) e queratinócito humano (HaCaT), usada como controle. Os inibidores de mTOR utilizados foram o temsirolimus, o everolimo, o resveratrol, a curcumina e o EGCG. O ensaio de viabilidade celular com o MTT foi realizado para obter a curva dose-resposta e determinação do IC50 para cada inibidor do mTOR. Para efeito de comparação entre os medicamentos, realizou-se análise da viabilidade celular em concentrações fixas de 50µM para os inibidores derivados da dieta e de 10µM para o everolimo e o temsirolimus. O pré-tratamento das células com os inibidores do mTOR no IC50 seguido por radioterapia foi realizado para avaliar efeito de radiossensibilização. O teste de lesão em monocamada foi realizado pós-tratamento com a curcumina e o everolimo. O perfil de morte celular induzido pelo tratamento com o temsirolimus, o resveratrol e a curcumina na linhagem HeLa foi avaliado pelo ensaio de citometria de fluxo. Os resultados mostraram que os inibidores do mTOR rapanálogos na concentração de 10µM e os derivados da dieta na concentração de 50µM induziram citoxicidade leve ou moderada nas 2 linhagens. Quando associados à radioterapia, os inibidores do mTOR apresentaram maior citotoxicidade em relação à radioterapia isolada. A curcumina interferiu no fechamento das feridas com as 2 linhagens de forma mais intensa que o everolimo. Observou-se ainda que o temsirolimus pode levar à apoptose tardia ou necrose após 24h de tratamento na linhagem HeLa. Dessa forma, podemos inferir que os inibidores do mTOR são ativos no tratamento do câncer do colo do útero e em especial associados à radioterapia.The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway is frequently activated in HPV-positive, squamous cell cancers, such as cervical cancer. This study aims to investigate the biological effects of mTOR inhibitors associated or not with radiotherapy in a HPV-positive cervical cancer cell (Hela). A human keratinocytes cells (HaCaT) was used as control. Temsirolimus, everolimus, resveratrol, curcumin and EGCG were the mTOR inhibitors evaluated. The MTT cell viability assay was performed in order to obtain the dose response curves and the IC50 for each mTOR inhibitor. As comparison among the mTOR inhibitors, a cell viability analysis was done in a fixed concentration of 50µM for the diet derived mTOR inhibitors and 10µM for everolimus and temsirolimus. The cells were also pre-treated with the mTOR inhibitors at IC50 followed by radiotherapy to evaluate the radiosensitization. The scratchy assay was performed with curcumin and everolimus. The cell death profile after treatment of HeLa cells with temsirolimus, resveratrol and curcumin was assessed with flow cytometry. The results showed that the rapanalogs in a a fixed concentration of 10 µM and the diet derived mTOR inhibitors in a fixed concentration of 50µM caused mild and moderate citotoxicity in both cell lines. The association of mTOR inhibitors with radiotherapy resulted in more intense citotoxicity than radiotherapy alone. Curcumin interferes more with wound closure than everolimus in both cell lines. After 24h, temsirolimus treatment can cause late apoptosis or necrosis in HeLa cells. Based on these data, mTOR inhibitors are active in thre treatment of cervical cancer, specially in association with radiotherapy